siRNA沉默Annexin��1 基因對膀胱癌T24細胞生物學特性的影響

【摘要】  目的 觀察RNA 干擾技術沉默Annexin��1基因表達對膀胱癌T24細胞增殖能力的影響。方法 針對Annexin��1基因不同部位設計并化學合成3對不同的靶向小干擾RNA(siRNA),脂質體介導瞬時轉染膀胱癌T24細胞，轉染后應用半定量RT�睵CR和Western印跡法檢測Annexin��1 mRNA和蛋白的改變，透射電鏡觀察細胞凋亡情況，用MTT法檢測沉默Annexin��1表達對膀胱癌T24細胞增殖的影響。結果 轉染siRNA后膀胱癌T24細胞Annexin��1 mRNA和蛋白水平顯著下降(P<0.05)，轉染siRNA沉默Annexin��1基因表達后膀胱癌T24細胞出現典型凋亡細胞，增殖能力顯著下降(P<0.05)。結論 RNA 干擾Annexin��1基因后其mRNA 和蛋白水平顯著下降，誘導了膀胱癌T24細胞凋亡，并且抑制細胞的增殖。

【關鍵詞】  膀胱癌;Annexin��1;siRNA

　　【Abstract】 Objective To explore the effects of Annexin��1 gene silencing by small interfering RNA(siRNA) on bladder cancer cells T24 in vitro. Methods Three siRNA targeting three different domains of Annexin��1 gene were designed, synthesized, and transfected into bladder cancer T24 cells by lipofectamineTM2000. After transfection, expression of Annexin��1 was detected by RT�睵CR and Western blotting. Transmission electronic microscope(TEM) was applied to observe the apoptosis cellular morphology. The cellular proliferation inhibitory ratio was eva luated by MTT assay. Results Compared with the negative control (siRNA�睳C) groups, transfection of three targeting siRNA in T24 cells decreased the expression of Annexin��1 mRNA and protein. Annexin��1 gene silencing reduced the proliferative capacity of T24 cells and leaded to tumor cells apoptosis after transfection. Conclusions The chemically synthesized specific siRNA targeting Annexin��1 could effectively reduce the expression of Annexin��1 gene, reduce the proliferative capacity of T24 cells and induce tumor cells apoptosis.

　　【Key words】 Bladder cancer; Annexin��1; siRNA

　 膜聯蛋白��1(Annexin��1)增強感染局部的凋亡表明它對腫瘤的診斷和治療有重要意義，因此該蛋白質與腫瘤細胞的活性調節相關〔1，2〕。目前，Annexin��1的表達缺失是否與膀胱癌細胞的異常增殖潛力相關以及對化療藥物的敏感性尚未明了，本研究利用RNA干擾(RNAi)技術通過沉默Annexin��1基因直接觀察Annexin��1表達缺失對膀胱癌細胞體外增殖能力的影響，為進一步揭示該基因促進腫瘤進展的機制提供理論依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料 膀胱癌T24細胞株(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院中心實驗室提供)，RNA干擾試劑盒(SilencerTM siRNA Construction Kit)購自美國Ambion公司。陽離子脂質體轉染試劑盒LipofectamineTM2000、Trizol、M�睲LV購自Invitrogen 生命技術公司。RPMI1640、IMDM、胰蛋白酶購自GIBCO公司。

　　1.2 小干擾RNA(siRNA)的設計及合成 根據GenBank 中Annexin��1基因序列(GenBank Accession No.NM000700)和siRNA設計原則，應用Ambion生物公司的設計軟件(siRNA Target Finder and Design Tools)，自Annexin��1 mRNA的起始密碼子開始，尋找“AA”二連序列，記下其3′端的19個堿基序列作為候選的siRNA靶序列。將候選序列在GenBank中用Blast軟件進行同源序列搜索，排除那些和其他基因編碼序列或EST同源的候選序列。最終選擇了3段21個堿基的siRNA序列(TI、TⅡ、TⅢ)，分別靶向Annexin��1基因的240��260 (SI) ，435��455 (SⅡ)和 506��526 (SⅢ)區域(見表1)。另外，根據轉染后細胞形態學變化，設計與TI(240siRNA)序列含有同樣核苷酸比例的隨機對照siRNA(240c1，240c2)做為陰性對照，用Blast驗證隨機序列與GenBank中其他已知人類基因序列沒有同源性。利用針對三磷酸甘油醛脫氫酶(β�瞐ctin)基因的正、反義寡核苷酸模板作為RNA干擾實驗的陽性對照。設計的正反義寡核苷酸模板3′端均加上T7啟動子引物5′CCTGTCTC3′，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

　　1.3 引物的設計與合成 設計1對Annexin��1的引物，上游：5′�睪ACCACCTCAACTCAAGGAC��3′,下游：5′�睞GGAAGCTGGATGAAGAGAC��3′，長度 546 bp，同時設計1對管家基因β�瞐ctin引物，上游：5′�睞CCACAGCTGAGAGGGAAATCG��3′，下游：5′�睞GAGGTCCTTACGGATGTCAACG��3′，長度290 bp，由上海生工合成。

　　1.4 細胞培養 常規RPMI1640培養，至轉染前夜，細胞培養液更換為用無血清和無抗生素的IMDM，置于37℃、 5% CO2孵箱,轉染后用20%FBS IMDM培養液,按常規方法培養,取處于對數生長期的細胞用于實驗。用Opti�睲EMⅠ轉染液及脂質體LipofectamineTM 2000轉染試劑，按試劑盒說明優化轉染條件，分別將3對siRNA和陽性對照篩選出的干擾序列的scramble siRNA(siRNA�瞡eg)以400 nmol/L的終濃度加入細胞培養液，孵育24、48、72 h后收獲細胞進行檢測。實驗重復3次。表1 靶向Annexin��1的siRNA核苷酸序列

　　1.5 半定量RT�睵CR檢測轉染前后膀胱癌T24 細胞Annexin��1 mRNA 的表達水平 Trizol試劑盒提取細胞總RNA，用2 μg總RNA進行cDNA的合成，半定量RT�睵CR方法檢測siRNA轉染后不同時間點24、48、72 h細胞中Annexin��1 mRNA表達水平，β�瞐ctin作內對照。PCR 擴增條件An