巨噬細胞炎癥蛋白��2在急性胰腺炎大鼠肺損傷中的作用

【摘要】  　　目的： 研究巨噬細胞炎癥蛋白��2(MIP��2)與急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP)大鼠肺損傷的關系。方法： 雄性SD大鼠，隨機分為5組，即正常對照組，AP 3 h,AP 6 h,AP 12 h,AP 24 h組，胰膽管逆行注射脫氧膽酸鈉，制備大鼠急性胰腺炎模型。測定血清淀粉酶，測定肺組織MIP��2含量和髓過氧化物酶（MPO）活性，胰腺組織和肺組織病理學檢查及評分。結果： AP 3 h組肺組織中MIP��2的含量即明顯升高，6 h達到高峰，和正常對照組比較差異有統計學意義；肺組織中MPO活力3 h開始升高，并隨時間推移而逐漸升高；AP 3 h組肺組織及胰腺組織病理學評分明顯高于正常對照組，在6 h及以后時段損傷表現更為嚴重。本研究結果中肺鏡下病理評分與胰腺鏡下病理評分(r=0.35,P<0.05）、肺組織MPO活性（r=0.42,P<0.05）呈正相關。結論： 急性胰腺炎病理過程中，MIP��2作為早期的促炎性細胞因子，趨化和激活了以中性粒細胞為主的炎性細胞，介導了肺損傷。

【關鍵詞】  蘇州大學附屬第二醫院 1.普外科; 2.檢驗科, 江蘇 蘇州 215004

　　［Abstract］Objective: To investigate the changes of macrophage inflammatory protein 2(MIP��2)in lung injury induced by acute pancreatitis(AP).Methods： SD rats were divided at random into five groups：AP 3 h group，AP 6 h group，AP 12 h group,AP 24 h group and control group， Rat AP model was induced by intraductal administration of 5% sodium deoxycholate（DCA）.Animals were sacrificed at 3,6,12,24 hours after induction of pancreatitis.The following parameters were measured:Serum amylase, the intrapulmonary content of MIP��2,myeloperoxidase(MPO) activity, histopathological scoring of lung and pancreatic tissues. Results： The intrapulmonary content of MIP��2 increased significantly in AP 3 h group, with peaking around 6 hours. Myeloperoxidase(MPO) activity overpressed in AP 3 h group and persisted up to 12～24 hours. Histopathological Score of lung tissues correlated well with Histopathological Score of pancreatic tissues(r=0.35,P<0.05）and intrapulmonary MPO(r=0.42,P<0.05）. Conclusion： MIP��2 was highly correlated with lung injury induced by AP, may induce pulmonary leucocyte infiltration and activation in the early stage.

　　［Key words］macrophage inflammatory protein��2; acute pancreatitis;   lung injury

    巨噬細胞炎癥蛋白��2(macrophage inflammatory  protein 2，MIP��2)是大鼠ELR+(含谷-亮-精氨酸功能基序)CXC類趨化性細胞因子,在功能上和人類IL��8同源，是中性粒細胞的主要趨化細胞因子［1］。急性肺損傷是急性胰腺炎（acute pancreatitis, AP）最常見和最突出的胰外臟器損傷之一，也是急性胰腺炎患者早期死亡的主要原因之一，有報道重癥急性胰腺炎發病1周內死亡的患者中，60％源于肺損傷［2］。本研究通過大鼠急性胰腺炎模型，探討MIP��2在大鼠急性胰腺炎肺損傷中的作用。

　　1  材料與方法工程論文發表

　　1.1  主要材料

    脫氧膽酸鈉為AMSCO公司產品；rMIP��2/GRO�拨翬LISA試劑盒為Biosource公司產品；髓過氧化物酶（MPO）試劑盒為南京建成生物工程研究所產品；DADE全自動生化分析儀，美國德林公司；Triturus ELISA全自動檢測儀，Dako公司；Biofuge 22R高速低溫離心機，Heraeus公司；DY89��1電動玻璃勻漿機，寧波新芝生物科技股份有限公司；Libror AEU��210精密電子秤(敏感度0.1 mg)，日本。

　　1.2  實驗動物及分組
       
　　健康清潔級雄性SD大鼠30只，體質量250～300 g，蘇州大學實驗動物中心提供。完全隨機化設計，分為5組即正常對照組，AP 3 h,AP 6 h,AP 12 h,AP 24 h，每組6只。

　　1.3  實驗方法

　　1.3.1  模型制備及取材

　　參照許利劍等［3］的方法制備大鼠急性胰腺炎模型：胰膽管逆行注射50 g/L脫氧膽酸鈉，劑量為1 ml/kg，勻速注射1 min，保留5 min,正常對照組除不注射脫氧膽酸鈉外，余操作同AP組。取下腔靜脈血離心后用全自動生化分析儀測定血清淀粉酶；切取肺組織2份，各約100 mg,用于MIP��2含量和MPO活性測定；分別取胰頭組織和肺組織做病理學檢查。

　　1.3.2  肺組織MIP��2含量測定

　　肺組織用10倍體積的預冷勻漿介質(含20 mmol/L pH7.4 PBS, 1 mmol/L PMSF和β琉基乙醇及EDTA, 5 g/L Triton X��100)制成勻漿，4℃, 14 000 r/min離心5 min，取上清液分成2份，一份用ELISA法檢測MIP��2濃度，采用ELISA全自動檢測儀按rMIP��2/GRO�拨翬LISA試劑盒供應商提供的說明書設定反應步驟；一份用全自動生化分析儀測定蛋白含量。肺組織的MIP��2含量用pg/mg蛋白表示:
MIP��2含量(pg/mg)=組織勻漿中的MIP��2濃度（pg/ml）組織勻漿中的蛋白含量（mg/ml）

　　1.3.3  肺組織MPO活性測定

　　取肺組織約100 mg，加入0.5%HTAB 2 ml,反復凍融并經超聲粉碎，離心，取上清液0.1 ml，加入反應液2.9 ml，在分光光度計460 nm波長下掃描，記錄第30 s和90 s光密度的差值，以此反映酶活力的改變［4］。
　
　　MPO活力單位(U/g)=△D(460 nm)/min11.3×所加組織量（g）/反應液（L）

　　1.3.4  病理學檢查

　　胰腺和肺組織標本常規固定、包埋、HE染色，病理科醫師在光鏡下觀察胰腺及肺組織學改變。胰腺組織鏡下病理評分采用Schmidt評分法［5］，以總分計；參照Pastor等［6］的方法進行肺組織學觀察與評分。

1.4  統計學處理

    采用SPSS10.0軟件進行統計分析。數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義，相關性檢驗采用線性回歸分析。

　　2  結 果

    大鼠血清淀粉酶、肺組織MPO活性及MIP��2含量、肺和胰腺組織病理評分結果見表1。正常對照組大鼠肺組織在光鏡下未見明顯病理變化；急性胰腺炎后3 h已出現肺組織損害，表現為肺泡間隔增寬、間質和肺泡出血、炎性細胞浸潤，隨著時間推移，損害更加明顯。肺鏡下病理評分與胰腺鏡下病理評分(r=0.35,P<0.05）、肺組織MPO活性（r=0.42,P<0.05）呈正相關。表1  各組大鼠血清淀粉酶、肺組織MPO活性、肺組織MIP��2含量、肺和胰腺病理評分的動態觀察（略）

　　3 討論

    肺損傷是重癥急性胰腺炎最常見和最突出的胰外臟器損傷之一，目前大量研究已經證實：中性粒細胞在肺部的浸潤和活化是急性胰腺炎肺損傷發生的關鍵所在，但其在肺部的浸潤、活化的機制尚未闡明。近年來MIP��2在其中的作用引起了關注。
   
　　MIP��2是1988年Wolpe等首次發現的一種新的蛋白質，可分為MIP��1,MIP��2,MIP��3,MIP��4,MIP��5共5種亞型。其中，MIP��2是一種與急性肺損傷密切相關的趨化性細胞因子，是C�瞂�睠亞家族成員之一，其氨基末端前2個半胱氨酸被1個其他氨基酸相隔，基因定位于人4號染色體，鼠5號染色體［7］。MIP��2由“α”和“β”兩種蛋白質亞單位組成，相對分子質量為6 kD。MIP��2是人IL��8的一個功能類似物［1］,通過對炎性細胞的化學趨化和活化作用而參與炎癥的全過程，其特異性靶細胞為中性粒細胞，大鼠中性粒細胞表面有對MIP��2高度親和的受體CXCR2，是MIP��2對中性粒細胞具有選擇性趨化和活化活性的結構基礎。 CXCR2活化后可引起白細胞內游離鈣升高，引起細胞骨架系統功能變化，導致白細胞變形、附壁、偽足形成并游出；具有肝素的結合位點，可與內皮細胞外基質中肝素硫酸葡聚糖相互作用，從而使得白細胞和血管內皮細胞的黏附更為牢固［8］。另一方面MIP��2還可動員骨髓中的白細胞釋放入血,當MIP��2濃度在1～10 mmol/L時，還可引起白細胞“呼吸爆發”［9］。Pastor等［6］就發現在雨蛙素誘導的小鼠AP肺損傷模型中, 用抗MIP��2抗體分別在制膜前后進行干預，可顯著抑制中性粒細胞浸潤、減輕胰腺和肺組織損傷的嚴重程度。工程論文發表
   
　　MPO存在于中性粒細胞的嗜天青顆粒中，約占細胞干重5％,通過檢測MPO的活力可以推算出中性粒細胞的數量［4］。

    本研究結果表明大鼠胰膽管逆行注射脫氧膽酸鈉后3 h，肺組織中MIP��2的含量即明顯升高，6 h達到高峰，12 h時開始下降；肺組織中MPO活力3 h開始升高，并隨時間推移而逐漸升高；從肺組織病理學檢查可見大鼠急性胰腺炎模型在3 h即可出現肺損傷：肺組織充血、腫脹，肺間質增寬，間質及肺泡出血、水腫、炎性細胞浸潤，在6 h及以后時段表現更為嚴重。本研究結果中肺鏡下病理評分與胰腺鏡下病理評分、肺組織MPO活性呈正相關，說明急性胰腺炎原發病變和急性胰腺炎肺損傷密切相關，中性粒細胞在肺部的浸潤和活化介導了肺損傷。MIP��2可能是炎癥早期的促炎性細胞因子，其在炎癥早期的短期急劇釋放可能趨化和激活了中性粒細胞等炎癥細胞，使之在肺內大量浸潤聚集，從而啟動與維持炎癥反應導致肺損傷。關于MIP��2的產生機制，目前研究不多，主要由激活的單核巨噬細胞、血管內皮細胞和中性粒細胞在LPS,TNF�拨�,IL��1等刺激下產生。我們的研究表明急性胰腺炎病理過程中，MIP��2作為早期的促炎性細胞因子，趨化和激活了以中性粒細胞為主的炎性細胞，介導了肺損傷。

【參考文獻】
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　　［3］許利劍，張建平，汪寶林,等. 銀杏葉提取物防治急性重癥胰腺炎大鼠內毒素血癥的實驗研究［J］. 江蘇大學學報：醫學版,2002,12(5):441-445.

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　　［6］Pastor CM, Rubbia�睟randt L, Hadengue A, et al. Role of macrophage inflammatory peptide��2 in cerulein�瞚nduced acute pancreatitis and pancreatitis�瞐ssociated lung injury［J］.Lab Invest, 2003,83(4):471-478.

　　［7］姜鵬，王建春，錢桂生.急性肺損傷大鼠肺組織PPARα mRNA表達的變化［J］.中國誤診學雜志，2005，5(6):1008-1011.

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