積雪草酸與化療藥物聯(lián)用抗腫瘤效應(yīng)的初步研究

【摘要】  　　目的： 研究積雪草酸（asiatic acid，AA）與化療藥物環(huán)磷酰胺（CTX），5�卜�尿嘧啶（5�睩u）聯(lián)用的抗腫瘤作用。方法： 采用在體與離體實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，觀(guān)察AA與5�睩u或CTX聯(lián)用對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2增殖和Heps肝癌腹水瘤、實(shí)體瘤生長(zhǎng)的影響。用MTT法檢測(cè)聯(lián)用AA和5�睩u的抗腫瘤效果。結(jié)果： 10，15，20，25 μmol/L AA與50，7.5，1 μmol/L 5�睩u聯(lián)用，具有顯著的抗腫瘤作用，AA不降低5�睩u對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用。AA和CTX聯(lián)用于Heps腹水瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)AA（50,100 mg/kg）和CTX（20 mg/kg）聯(lián)用與單用CTX一樣，能抑制腹腔積液的增生，且可延長(zhǎng)Heps腹水瘤小鼠的壽命；AA和CTX聯(lián)用于Heps實(shí)體瘤小鼠，有明顯的抑瘤作用，而且AA能對(duì)抗CTX誘導(dǎo)的谷胱甘肽（GSH）水平的降低，可能對(duì)肝臟的抗氧化能力有一定的保護(hù)作用。結(jié)論： AA與化療藥物聯(lián)用，可以減弱化療藥物的毒副作用。

【關(guān)鍵詞】  積雪草酸； 5�卜�尿嘧啶； 環(huán)磷酰胺； 聯(lián)合用藥； 抗腫瘤

　　［Abstract］Objective: Study the anti�瞭umor effects of asiatic acid（AA）combined with chemotherapeutics cyclophosphamide(CTX) or 5�瞗luorouracil(5�睩u).  Methods： The cytotoxic effects of the combination of AA and 5�睩U on tumor cell lines HepG2 were detected by MTT assay.Mice transplanted with Heps solid tumor and ascites carcinoma were used to study the combination anti�瞭umor effect of AA(50,100 mg/kg) and CTX(20 mg/kg).  Results： When AA(10, 15, 20, 25 μmol/L) and 5�睩u(50, 7.5, 1 μmol/L) was combinated to treat the cells, the growth of HepG2 cells were inhibited obviously. On the other hand, AA prolonged the survival time of mice with Heps ascites carcinoma compared with those in CTX group and showed significant anti�瞭umor activity simultaneously. The protection of AA on hepatic GSH level insulted by CTX in mice with Heps solid tumor treated with AA and CTX confirmed the attenuated toxicity effects of AA, which might be associated with hepatopretection of AA. Conclusion： The present data suggest that AA attenuate the toxicity of some chemotherapeutics and may be helpful in cancer treatment with the combination of chemotherapeutics.
［Key words］  asiatic acid; 5�瞗luorouracil; cyclophosphamide; drug�瞔ombination; antitumor

    腫瘤已成為人類(lèi)致死的三大疾病之一。目前臨床使用的環(huán)磷酰胺（CTX），5�卜�尿嘧啶（5�睩u）等抗腫瘤藥物化療時(shí)均產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)，引起正常組織的多器官毒性、免疫抑制、反復(fù)感染， 機(jī)體衰弱等現(xiàn)象［1, 2］。本實(shí)驗(yàn)室已有的研究也發(fā)現(xiàn)CTX通過(guò)影響小鼠肝臟線(xiàn)粒體功能從而導(dǎo)致肝損傷［3］。我國(guó)一些傳統(tǒng)中藥因其較少的不良反應(yīng) 、對(duì)機(jī)體具有保護(hù)和調(diào)理作用, 成為中西藥聯(lián)合化療的研究熱點(diǎn)。研發(fā)新型抗腫瘤增效、減毒劑可能是戰(zhàn)勝惡性腫瘤的途徑之一［4］。 
   
　　積雪草酸（asiatic acid，AA），又名亞細(xì)亞酸，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥積雪草的五環(huán)三萜類(lèi)組分之一。經(jīng)研究證明，AA具有促進(jìn)成纖維蛋白合成［5, 6］、對(duì)抗CCl4和D�睪alN誘導(dǎo)的肝損傷［7］、對(duì)抗神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷［8］等細(xì)胞保護(hù)作用。另外，也發(fā)現(xiàn)AA具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用［9, 10］。但是對(duì)于AA應(yīng)用于在體抗腫瘤治療的實(shí)驗(yàn)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究將在體與離體實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，觀(guān)察了AA與5�睩u或CTX聯(lián)用對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2增殖和Heps肝癌腹水瘤、實(shí)體瘤生長(zhǎng)的影響。財(cái)會(huì)論文發(fā)表
  
　　1  材料和方法

　　1.1  材料

    人肝癌細(xì)胞株（HepG2）：南京大學(xué)徐力致老師惠贈(zèng)；ICR小鼠（雄性），體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2002－0009。動(dòng)物飼養(yǎng)晝夜循環(huán)為10/14 h，環(huán)境溫度為25℃左右，自由飲食進(jìn)水；Heps腹水瘤種鼠源自江蘇省腫瘤醫(yī)院；MTT（Sigma公司）；5�睩u（上海旭東海普藥業(yè)有限公司）；積雪草酸，純度95%（廣西昌洲天然產(chǎn)物有限公司），用于在體實(shí)驗(yàn)的AA用β�箔h(huán)糊精包埋，由江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院張蓉仙老師制備；環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H32020857）；β�箔h(huán)糊精（南京中脈遠(yuǎn)紅股份有限公司謝家坤高工惠贈(zèng)）；谷胱甘肽（GSH）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

　　1.2  離體實(shí)驗(yàn)

　　1.2.1  細(xì)胞培養(yǎng)

　　HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10 %小牛血清的MEM培養(yǎng)基。細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5 % CO2的孵箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。

　　1.2.2  實(shí)驗(yàn)分組

　　將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，接種密度為2×104 個(gè)/ml，每孔100 μl。培養(yǎng)24 h后，加入10，20，30，40 μmol/L AA，48 h后用檢測(cè)細(xì)胞活性，分析AA對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。采用50，7.5，1  μmol/L的5�睩u分別與不同濃度AA（10，15，20，25 μmol/L）聯(lián)合用藥。以含1‰ DMSO的培養(yǎng)基為對(duì)照。

　　1.2.3  MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

　　96孔培養(yǎng)板中細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，棄去培養(yǎng)基，每孔加100  μl MTT（D�瞙ank′s液溶解，1 mg/ml），37℃孵育4 h后，吸去上清，每孔加DMSO 100  μl，待結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀（Spectrum 190，Moleculer Devices）于570 nm處測(cè)光密度值。

　　1.3  在體實(shí)驗(yàn)

　　1.3.1  荷瘤小鼠模型

　　Heps腹水瘤模型:取Heps腹水瘤小鼠，處死后浸泡于75%乙醇5 min，腹腔穿刺取腹腔積液，計(jì)數(shù)稀釋至1×107個(gè) /ml，取0.2 ml腫瘤細(xì)胞懸液接種于ICR小鼠腹腔。Heps實(shí)體瘤模型：同Heps腹水瘤模型，制備2×107個(gè)/ml的Heps瘤細(xì)胞懸液，0.2 ml/只，接種于ICR小鼠右側(cè)腋下。
1.3.2  實(shí)驗(yàn)分組

　　荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組，對(duì)照組、CTX組、低劑量AA和CTX聯(lián)用組、高劑量AA和CTX聯(lián)用組及高劑量AA組，每組10 只。于腹腔接種瘤細(xì)胞的次日開(kāi)始給藥，聯(lián)合用藥組每日皮下注射CTX（20 mg/kg）并分別灌胃低劑量（50 mg/kg）和高劑量（100 mg/kg）AA；CTX組皮下注射CTX（20 mg/kg），以等量環(huán)糊精灌胃作為對(duì)照；高劑量AA組灌胃高劑量AA（100 mg/kg），皮下注射等量生理鹽水。對(duì)照組皮下注射等量生理鹽水，灌胃等量環(huán)糊精。

    腹水瘤小鼠存活率檢測(cè)分3組：對(duì)照組,20 mg/kg CTX組，50 mg/kg AA和20 mg/kg CTX聯(lián)用組。

　　1.3.3  腹水瘤小鼠存活率分析

　　觀(guān)察小鼠的存活情況，并記錄每天存活小鼠只數(shù)，進(jìn)行生存期比較。存活率=存活小鼠/小鼠總數(shù)×100%

　　1.3.4  實(shí)體瘤小鼠抑瘤率檢測(cè)

　　給藥15 d后，小鼠眼底靜脈叢取血，然后頸椎脫臼處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤組織，稱(chēng)重，計(jì)算腫瘤抑制率。

　　1.3.5  肝臟GSH含量檢測(cè)

　　取肝臟左大葉相同部位肝組織，用適量生理鹽水制備成10%組織勻漿，試劑盒檢測(cè)GSH含量。

　　1.4  統(tǒng)計(jì)方法

　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SAS軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），組間比較作SNK�瞦檢驗(yàn)。顯著性標(biāo)準(zhǔn)為α＝0.05。腹水瘤小鼠存活率比較用χ2檢驗(yàn)。

　　2  結(jié)  果

　　2.1  AA對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響

    如圖1所示，AA的劑量小于20 μmol/L時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響；當(dāng)劑量達(dá)到30 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活性顯著降低；隨著劑量的繼續(xù)加大，抑制細(xì)胞增殖的作用逐漸加強(qiáng)。

　　2.2  AA和5�睩u聯(lián)用抑制腫瘤細(xì)胞增殖

    采用10, 15，20，25 μmol/L的AA，分別與50，7.5，1 μmol/L 5�睩u聯(lián)用。結(jié)果如圖2所示。隨著5�睩u濃度的降低，5�睩u和AA聯(lián)用的抗腫瘤效果也逐漸降低。10, 15，20，25 μmol/L 的AA和5�睩u聯(lián)用后抗腫瘤趨勢(shì)與單用5�睩u的趨勢(shì)一致。說(shuō)明AA對(duì)3個(gè)濃度 5�睩u的抗腫瘤效果均沒(méi)有影響。財(cái)會(huì)論文發(fā)表

　　2.3  AA與CTX聯(lián)用對(duì)Heps腹水瘤小鼠存活率的影響

　　由圖3可以看出： CTX組小鼠出現(xiàn)死亡較早，和AA聯(lián)用后，死亡延緩。說(shuō)明AA有降低CTX毒性，延長(zhǎng)荷瘤鼠壽命的作用。
   
    接種腫瘤后第14天荷瘤小鼠存活率統(tǒng)計(jì)分析表明，20 mg/kg CTX組小鼠的存活率低于對(duì)照組，說(shuō)明CTX抑瘤的同時(shí)產(chǎn)生了明顯的毒性作用；而AA與CTX聯(lián)用組小鼠的存活率有所提高，提示AA有延長(zhǎng)荷瘤小鼠壽命、降低CTX毒性的作用（表1）。表1  化療第14天各組荷瘤鼠的存活率（略）

    2.4  AA與CTX聯(lián)用抑制Heps實(shí)體瘤的作用
   
　　由圖4可以看出：20 mg/kg CTX對(duì)Heps實(shí)體瘤具有良好的抑制作用，單用100 mg/kg AA 的抗腫瘤活性較弱，兩者聯(lián)用后具有顯著的抗腫瘤作用，50，100 mg/kg AA均沒(méi)有減弱CTX的抗腫瘤活性。
   
　　2.5  AA與CTX聯(lián)用對(duì)荷瘤小鼠抗氧化能力的影響

    從圖5可以看出：CTX組荷瘤小鼠肝組織中GSH含量顯著下降，而AA和CTX聯(lián)用組GSH含量和對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明AA對(duì)抗了CTX 誘導(dǎo)的荷瘤小鼠肝臟GSH水平的降低。

　　3 討論

    AA對(duì)不同腫瘤細(xì)胞具有不同的抗腫瘤機(jī)制［9,10］，低劑量時(shí)則可以保護(hù)細(xì)胞對(duì)抗損傷［5，7］。本研究首次將AA應(yīng)用于中西藥聯(lián)合化療，通過(guò)AA和5�睩u聯(lián)用，觀(guān)察體外聯(lián)合用藥的效果；AA和CTX聯(lián)用，觀(guān)察在體抗腫瘤的效果。結(jié)果表明，選擇合適的劑量，可以使AA在不影響抗腫瘤藥物作用的前提下，發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)作用。
  
　　之前有文獻(xiàn)報(bào)道：在CTX引起的肝毒性過(guò)程中，自由基和氧化應(yīng)激是兩個(gè)不可忽視的因素，兩者導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的劇烈進(jìn)行，胞內(nèi)抗氧化防御體系通過(guò)非酶促反應(yīng)清除自由基，GSH 迅速耗竭［11］。從Heps實(shí)體瘤模型結(jié)果可知， AA對(duì)抗CTX誘導(dǎo)的肝臟GSH活性的降低，提示AA對(duì)肝臟具有保護(hù)作用，這與以前的研究結(jié)果一致［8］。
   
　　AA單獨(dú)應(yīng)用沒(méi)有發(fā)揮理想的抑瘤作用，而影響藥物作用的因素很多，且由于實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到AA的水溶性不好，我們推測(cè)生物利用度不高可能是重要的影響因素之一。因此也許通過(guò)改變AA的劑型，使其在體內(nèi)能達(dá)到抗腫瘤的血藥濃度，可以進(jìn)一步研究AA的在體抗腫瘤效果，為AA 的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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