ALOX5AP基因SG13S114T/A多態性與急性心肌梗死的相關性

【摘要】  目的： 探討中國蘇南地區漢族人群5�仓�氧合酶激活蛋白(ALOX5AP)基因SG13S114T/A多態性與急性心肌梗死(AMI)的相關性。 方法： 以300例AMI患者(AMI組)和415例非冠心病患者(對照組)作為研究對象，應用聚合酶鏈反應限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)方法檢測ALOX5AP基因SG13S114T/A多態性。 結果： (1) 與對照組相比，AMI患者TT和AT基因頻率均明顯升高，且頻率分布都有統計學意義(P分別為0.027,0.032);T等位基因頻率分布差異無統計學意義(59.50%和64.82%，P=0.324)。(2)亞組分析：男性AMI患者的AA，AT，TT基因型和T等位基因頻率均無統計學差異，而女性TT基因型與AMI的發生存在相關性(P=0.042)。對多個危險因素行多元Logistic回歸分析顯示ALOX5AP基因SG13S114T/A AT和TT基因型與AMI的發生密切相關(P值分別為0.000，0.001)。T等位基因頻率具有統計學意義(P=0.038)。AT和TT基因型與男性和女性AMI的發生均存在相關性(男性P值分別為0.010，0.040;女性P值分別為0.010，0.004)，T等位基因與女性AMI的發生也有關聯(P=0.026)，而T等位基因與男性AMI的發生無相關性(P=0.285)。 結論： 在中國蘇南地區漢族人群中，ALOX5AP基因SG13S114T/A TT和AT基因型可能是蘇南地區漢族人群AMI的易感基因型，T等位基因可能是AMI發病的重要遺傳危險因素，并與女性AMI的發病存在相關性。

【關鍵詞】  5�仓�氧合酶激活蛋白; 基因多態性; 急性心肌梗死

　[Abstract] Objective: To investigate the association between 5�瞝ipoxygenase activating protein(ALOX5AP)gene SG13S114T/A polymorphism and acute myocardial infarction(AMI) in the Chinese Han population of Sunan region. Methods: All of 300 patients with AMI and 415 control subjects free from coronary artery disease were recruited into the study. The ALOX5AP SG13S114T/A polymorphism gene was determined by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis(PCR�睷FLP). Results: (1) Compared with the control group, there was statistical difference of the frequencies of TT and AT genotype in the AMI group (P value was 0.027 and 0.032 respectively); the frequencies of T allele was not significantly different(59.50%vs 64.82%,P=0.324). (2)sub group revealed：The frequencies of AA,AT,TT genotype and the T allele of the SG13S114T/A had no association with AMI in male group, but the frequency of TT genotype had significant correlation with AMI in female. Multivariate logistic regression analysis indicated that there was significantly correlation between ALOX5AP gene SG13S114T/A AT and TT with AMI(P value was 0.000 and 0.001 respectively).T allele had significantly association with AMI(P=0.038). There was statistical difference of the frequencies of AT and TT genotype with AMI in both male and female(P value was 0.010 and 0.040 respectively in male group; P value was 0.010 and 0.004 respectively in female group), T allele was a significant risk factor for AMI in the female carrier (P=0.026), but had no association with AMI in male (P=0.285). Conclusion: The ALOX5AP gene SG13S114T/A polymorphism may be associated with the susceptibility to AMI in the Chinese Han population of Sunan region. The T allele was a significant genetical risk factor for AMI and was the susceptibility to AMI in the female.中醫論文發表

　　[Key words] 5�瞝ipoxygenase activating protein; gene polymorphism; acute myocardial infarction

　　目前認為急性心肌梗死(AMI)是一種炎癥型疾病，與多種環境因素和遺傳因素有關。5�仓�氧合酶激活蛋白(5�瞝ipoxygenase activating protein, FLAP)/ 5�仓�氧合酶(5�瞝ipoxygenase, 5�睱O)通路的一個基因突變體(ALOX5AP)是AMI的敏感因素[1]，ALOX5AP是冠心病或腦卒中發病的一個獨立的危險因子，1個ALOX5AP單倍體HapA就可以使冰島人群患心肌梗死和腦血管病的風險增高2倍[2]，ALOX5AP基因HapB單倍型也可以增加英國人群心肌梗死(MI)的風險性[3]，與德國人心肌梗死的發病率也顯著相關[4]，但在瑞典和美國西部人群中ALOX5AP基因與心肌梗死或腦卒中的發生無相關性[5-6]。另外，Zhang等[7]研究表明，ALOX5AP基因SG13S114T/A單核苷酸多態性(SNP)與腦梗死有相關性，但它是否與中國漢族人群AMI發病存在相關性尚未見報道。本研究以蘇南地區漢族人群為研究對象，探討ALOX5AP基因SG13S114T/A多態性與AMI的相關性。

　　1 對象與方法

　　1.1 研究對象

　　1.1.1 AMI組

　　2005年6月至2010年5月在江蘇大學附屬武進醫院心內科住院的AMI患者300例，男218例，女82例，年齡31～92(65.38±10.94)歲。診斷均符合2002年AHA/ACC關于AMI的診斷標準。

　　1.1.2 對照組

　　選擇同期住院并行冠脈造影排除冠狀動脈病變者415例，男211例，女204例，年齡16～86(61.18±11.33)歲。所有研究對象均經本院醫學倫理委員會批準，并征得所有入選對象知情同意。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 一般資料采集

　　使用統一表格記錄所有入選對象的基本資料，如性別、年齡、吸煙史、高血壓史、糖尿病史、家族史、血糖、血脂及冠脈造影等各項結果。

　　1.2.2 基因組DNA的提取

　　抽取外周靜脈血2 ml，置入EDTA抗凝管，分離血漿和白細胞，以酚氯仿法提取白細胞DNA，-70 ℃保存。

　　1.2.3 PCR擴增目的基因片段

　　以基因組DNA為模板，體外擴增ALOX5AP基因位于染色體的13q12-13，長度為31 kb DNA片段。PCR引物序列為上海生物技術工程有限公司合成，上游引物為5′GTGTTCAGGAAGGGAGTTTCTGT3′，下游引物為5′GTCTATGGTTGCAACATTGAGATTA3′。PCR反應體系25 μl ：基因組DNA 1 μl，10 pmol上、下游引物各1 μl，Premix EX Taq DNA聚合酶(大連寶生物工程有限公司)12.5 μl, 去離子水9.5 μl。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min;反應循環：變性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 40 s，共30個循環;最后72 ℃延伸10 min。反應結束后取PCR產物4 μl，2%瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙啶)，凝膠成像分析儀分析PCR擴增結果。

　　1.2.4 PCR產物限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析

　　酶切反應體系20 μl，其中10 μl PCR反應產物，緩沖液2 μl，限制性內切酶VspⅠ(TaKaRa)和去離子水7.5 μl，37 ℃溫育過夜。酶切產物于3%瓊脂糖凝膠電泳35 min，凝膠成像儀判斷酶切結果。基因型分為AA(25 bp)純合型;AT雜合型(212 bp,187 bp和25 bp)和TT純合型(212 bp)。取部分PCR擴增產物進一步測序鑒定。

　　1.2.5 統計學分析

　　應用SPSS 16.0軟件進行統計分析。計量資料以x±s表示并采用t檢驗， ALOX5AP基因型和等位基因頻率采用頻率計數法計算，研究對象基因型與Hardy�瞁einberg平衡的符合程度和計數資料比較采用χ2檢驗,關聯程度用優勢比(odds ratio, OR)和95%可信區間(confidence interval, CI)表示，AMI的多種相關因素分析采用Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統計學意義。

　　2 結 果

　　2.1 AMI組與對照組的臨床資料比較

　　與對照組相比，AMI組年齡較大，男性吸煙者，高血壓和糖尿病比例較高，LDL明顯增高(表1)。表1 AMI組和對照組一般臨床資料比較

　　2.2 基因多態性分型

　　ALOX5AP基因SG13S114T/A多態位點經PCR擴增后獲得目的片段大小為212 bp。由于T等位基因不存在VspⅠ內切酶酶切位點，而A等位基因存在該酶切位點，因此PCR擴增產物經內切酶消化后，在瓊脂糖凝膠電泳中可以觀察到3種基因型：TT純合型(212 bp)、AT雜合型(212 bp、187 bp和25 bp)和AA純合型(187 bp和25 bp)(圖1)。PCR產物經測序進一步驗證(圖2)。

　　2.3 基因多態性分析中醫論文發表

　　ALOX5AP基因SG13S114T/A單核苷酸多態性(SNP)在AMI組和對照組中均存在AA、AT和TT三種基因型，AMI組和對照組基因型分布經χ2檢驗均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，表明入選樣本具有群體代表性。與對照組相比，AMI組AT和TT基因型頻率明顯增高(P值分別為0.032和0.027)。由于AMI組和對照組臨床資料不相匹配而對AA、AT和TT三種基因型以及T等位基因行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，ALOX5AP基因SG13S114T/A SNP AT和TT基因型以及T等位基因與AMI的發病密切相關(P分別為0.000、0.001和0.038)。見表2。1：陰性對照;2：AA基因型(187 bp和25 bp);4、6、7：TT基因型(212 bp);3、5、8：AT基因型(212 bp、187 bp和25 bp);9：20 bp 標準參照物。圖1 ALOX5AP基因SG13S114T/A PCR產物酶切電泳圖圖2 ALOX5AP基因SG13S114T/A多態性PCR產物測序圖表2 ALOX5AP基因SG13S114T/A多態性AT和TT基因型與AMI的關系

　　2.4 不同性別ALOX5AP基因SG13S114T/A分析

　　男性AMI患者的AA，AT，TT基因型和T等位基因頻率均無統計學差異，而女性TT基因型與AMI的發生存在相關性(P=0.042)。在調整吸煙、年齡，BP，TC，TG，HDL，LDL，Glu等危險因素并經Logistic回歸分析后，AT和TT基因型與男性和女性AMI的發生均存在相關性(男性P值分別為0.010，0.040;女性為0.010，0.004)，T等位基因與女性AMI的發生也有關聯(P=0.026)，而T等位基因與男性AMI的發生無相關性(P=0.285)。見表3。表3 不同性別AMI患者 ALOX5AP基因SG13S114T/A多態性分布

3 討 論

　　ALOX5AP基因是編碼FLAP的基因，位于染色體的13q12-13，包含5個外顯子、4個內含子，長度為31 kb [8]，其5’側翼端含有一個TATA box和GRE(glucocorticoid response element)，AP��1和AP��2(the activation of the transcription factors)轉錄子的結合位點 [9]，該基因編碼區含有多個單核苷酸多態性(SNP)，SNP的突變率較高，推測在這些SNP中可能存在著功能性突變，影響FLAP的合成或影響其活性。5�仓�氧合酶(5�瞝ipoxygenase, 5�睱O)是白三烯合成過程中的重要酶。白三烯是重要促炎標志物，可以激活白細胞和附著在血管內皮細胞層的單核細胞，增加血管的通透性[10] 。ALOX5AP的突變增加了動脈血管壁白三烯的產生和炎癥介質的分泌，從而引發血管炎癥和動脈粥樣硬化的形成，最終導致管壁狹窄、斑塊損壞和破裂。在急性冠脈綜合征(ACS)患者中，ALOX5AP水平升高預示患者危險性增加。

　　本研究表明ALOX5AP基因TT、AT基因型與AMI的發病密切相關，與對照組相比，頻率顯著升高且差異有顯著意義，將結果進行Logistic回歸分析TT和AT基因型仍具有顯著性意義，說明其可能并不獨立于血壓、血糖、血脂和吸煙等因素之外，是AMI的易感基因，但可能和其他危險因素一起在AMI的發病中起作用。 兩組T等位基因行多個相關危險因素Logistic分析比較也有相關性，說明ALOX5AP基因SG13S114T/A多態性的T等位基因可能是該研究人群AMI發病的重要遺傳危險因子。進一步分析發現，男性AMI患者的AA，AT，TT基因型和T等位基因頻率均無統計學差異，而女性TT基因型與AMI的發生存在相關性。但經多因素Logistic回歸分析后，AT和TT基因型與男性和女性AMI的發生均存在相關性，T等位基因與女性AMI的發生也有關聯，而T等位基因與男性AMI的發生無相關性，提示ALOX5AP基因SG13S114T/A多態性AT，TT基因型和T等位基因與女性AMI的發病更密切相關，不管是否存在影響AMI發病的其他因素，攜帶該基因型及T等位基因的女性有發生AMI的潛在性。ALOX5AP基因是如何增加AMI的患病風險還不清楚，目前認為這可能是由于ALOX5AP編碼的FLAP是炎癥介質白三烯產生旁路的一個調節點，是5�睱O的結合蛋白，受白細胞的限制，并可被各種刺激引發[11]。當FLAP活性增高時，它使5�睱O的活性也增高，二者活性的改變使白三烯大量分泌，激活白細胞、促進單核細胞和內皮細胞的黏附，增加血管通透性，刺激新生內膜增生，導致動脈粥樣硬化，最終導致斑塊破裂血栓形成，AMI發生。

　　ALOX5AP基因多態性與AMI相關可能與下列因素有關。ALOX5AP 是編碼FLAP的基因，FLAP促進炎性細胞因子的合成，而炎性細胞因子由各種炎癥細胞分泌，這些炎癥細胞聚集于受損血管壁側，最終導致動脈粥樣硬化形成。因此FLAP被認為是動脈粥樣硬化炎癥反應的關鍵調節因子[12]，它與花生四烯酸結合激活5�睱O途徑，5�睱O使巨噬細胞、樹突狀細胞、泡沫細胞、桿狀細胞和嗜中性粒細胞聚集。當損傷進一步加重時，細胞表達5�睱O的數量將顯著增加，并促進5�睱O聚積在那些即將破裂的部位，如動脈粥樣硬化斑塊纖維帽兩側，引起斑塊破裂并觸發血栓形成，導致冠狀動脈管腔完全或不完全閉塞。在FLAP/5�睱O通路中，5�睱O通過氧化花生四烯酸生成白三烯B4(LTB4)[13]，其中LTB4是潛在的中性白細胞、巨噬細胞和其他炎性細胞的化學誘導劑[14]，導致動脈粥樣硬化和血管管腔狹窄，促使ACS的發生。

　　本研究結果與國外研究結論不盡相同，可能原因為：① 樣本量相對較小，對統計學結果會產生一定影響;② 樣本的不均一性，如種族、性別和發病年齡;③ 該位點的多態性變異對AMI的作用可能受環境及其他因素的影響。

　　綜上所述，ALOX5AP基因SG13S114T/A TT和AT基因型可能是蘇南地區漢族人群AMI的易感基因型，T等位基因可能是AMI發病的重要遺傳危險因素，并與女性AMI的發病密切相關，但與AMI的確切關系及對其預后和生存率的影響還需多中心、大樣本、前瞻性的研究及在功能學方面深入研究。

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