霍奇金淋巴瘤化療前后血清蛋白指紋圖譜的變化

【摘要】  目的： 探討霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)患者化療前后血清蛋白指紋圖譜變化，以尋找與其療效有關的血清蛋白生物標記。方法： 應用表面增強激光解析離子飛行時間質譜技術(SELDI�睺OF�睲S)檢測18例初診和16例化療后HL患者血清，并取21例正常對照的血清，用CM10蛋白芯片獲得血清蛋白表達指紋圖譜，用Biomarker Wizard3.1軟件對檢測數據進行統計學分析。結果： 化療前后HL患者差異表達31個蛋白質M/Z，其中有25個蛋白質在化療后HL血清高表達，有6個蛋白質低表達;化療后HL和正常對照存在3個沒有統計差異的蛋白質。結論： 應用SELDI�睺OF�睲S可篩選HL患者血清中的標志蛋白，可為HL患者診斷、分期、多藥耐藥性檢測、療效判斷以及早期復發預測等方面提供客觀有用的信息。

【關鍵詞】  表面增強激光解析離子飛行時間質譜技術; 霍奇金淋巴瘤; 化療; 蛋白指紋圖譜

　[Abstract] Objective: To explore the serum proteome profiles changes of pre�瞐nd post�瞔hemotherapy Hodgkin lymphoma patients, and to search the serum biomarkers for the therapeutic effect of HL. Methods： Surface�瞖nhanced lastexdesorption/ionization�瞭ime of flight�瞞ass spectra (SELDI�睺OF�睲S) was used to detect the sera of 34 HL patients and 21 control cases, 18 newly diagnosised patients and 16 post�瞔hemotherapy patients. The Biomarker Wizard 3.1 system software was applied to analyze the data from the serum protein mass spectra by CM10 proteinchip array. Results： Thirty�瞣ne protein mass peaks were found differently expressed between the sera of newly diagnosised and post�瞔hemotherapy HL patients. Twenty�瞗ive proteins were up�瞨egulated and six down�瞨egulated in sera of post�瞔hemotherapy HL cases. Thirty proteins are found no differently expressed between the sera of post�瞔hemotherapy HL patients and control ones. Conclusion： SELDI�睺OF�睲S may be used to screen the serum biomarkers of HL and might provide objective useful information for diagnosising, staging, detecting MRD, and to judge therapeutic effect, and predict earlier relapse of HL.

　　[Key words] SELDI�睺OF�睲S; Hodgkin lymphoma; chemotherapy; proteome profiles

　　表面增強激光解析離子飛行時間質譜技術(SELDI�睺OF�睲S)是一種新的可高通量檢測蛋白質的技術，其芯片表面可結合特異的蛋白質。該技術應用范圍廣，如探討細胞凋亡機制[1]，腫瘤的早期診斷、療效檢測、復發早期預警及患者預后評估，發病機制的探討等，并且在血液系統疾病中有了一定應用[2]。本實驗應用該技術對霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)患者化療前后血清中差異表達蛋白質進行分析，以尋找與HL療效有關的差異表達蛋白質。教師評職稱論文發表

　　1 材料與方法

　　1.1 病 例

　　34例HL患者血清標本均來自2006年11月至2008年5月瀘州醫學院血液科和腫瘤科住院患者，并經過組織病例活檢和免疫組織化學染色確診，年齡15～75歲，其中初診病例18例，男10例，女8例;化療后病例16例(ABVD方案化療大于或等于4次)，男9例，女7例，完全緩解12例，部分緩解4例。正常對照21例為門診體檢者，男14例，女7例，年齡12～76歲。

　　1.2 主要試劑與儀器

　　乙腈、尿素(Urea)、三氟乙酸(TFA)、芥子酸(SPA)、Tris�睭CI pH 9.0、3�箔h己胺��1�脖�磺酸(CHAPS)、NaAc、PBS緩沖液(×10)、HPLC H2O、1N HCl等均購自美國Sigma公司。PBSⅡ/C型蛋白質指紋圖譜儀、CM10(弱陽離子交換表面)蛋白芯片由美國Ciphergen公司生產。

　　1.3 方 法

　　1.3.1 收集標本

　　抽清晨空腹靜脈血2～3 ml，置于BD真空管內(不抗凝)，半小時內放入4℃冰箱靜置1 h，3 000 r/min短暫離心，取上清液加入Eppendof管內;再4 ℃ 3 000 r/min離心5 min，0.25 ml Eppendof管編號、分裝，30 μl每管，每個樣本至少分裝5管，放入-80 ℃冰箱保存備用。

　　1.3.2 制備樣品混合液

　　取96孔細胞培養板放冰盒上，每孔加入10 μl U9(9 mol/L Urea，2% CHAPS，1% DTT)，置于冰盒表面。取出凍存的血清標本，置于冰上溶解后4 ℃ 10 000 r/min離心2 min，將分離的血清加入上述含10 μl U9的細胞培養板孔，每孔5 μl，4 ℃環境中600 r/min振蕩30 min。每孔加入185 μl結合緩沖液(50 mmol/L NaAc，pH 4.0)，立即置于4 ℃環境中600 r/min振蕩2 min混勻。

　　1.3.3 上樣及洗脫

　　將CM10芯片裝入Bioproeessor中，記下芯片號，用排槍加200 μl 150 mmol/L pH 4.0 NaAc，在層析柜中600 r/min振蕩5 min，拍干，重復一次。待30 min后用排槍快速加入185 μl NaAc(總量計200 μl)于96孔板，垂直用力打出，不碰底，不吹吸，層析柜中600 r/min振蕩2 min左右混勻。用排槍加100 μl處理好的樣本到芯片上，快速加，用手輕拍加樣板以去除氣泡，還有氣泡的用槍頭吹吸，用密封條密封后，層析柜中600 r/min 4 ℃振蕩1 h，甩掉樣本，用力拍干。用排槍加200 μl NaAc，600 r/min 常溫下5 min，甩掉，用力拍干，重復3次。快速加HPLC水200 μl，甩掉，用力拍干，重復2次取出芯片，放置晾干后加半飽和SPA 1 μl，5 min后再加1 μl，晾干后即可上機檢測。
1.4 采集數據

　　利用PBS Ⅱ/C型蛋白質指紋圖譜儀對結合在CM10芯片表面的血清蛋白質進行檢測，設定最高檢測相對分子質量為100 000，優化范圍為2 000～20 000，激光強度210，檢測敏感度為9。儀器采用Ciphergen公司提供的all�瞚n�瞣ne標準分子質量蛋白質進行校正，系統的質量偏差≤0.1%。采用Ciphergen Proteinchip軟件自動采集實驗數據并進行降低基線和均一化處理。

　　1.5 統計學處理

　　利用Ciphergen Proteinchip軟件對獲得的混合對照血清圖譜進行分析并計算其差異性，以變異系數(CV)值表示，設定CV<15%時，不同芯片之間的實驗誤差為可接受范圍。采用Biomarker Wizard 3.1軟件對實驗數據進行聚類分析和統計學處理，設定有意義的蛋白質峰出現頻率閾值為10%，進行2次信噪比(S/N)過濾。確定兩組間蛋白質峰值比較時，對初步篩選的蛋白質峰進行t檢驗，P<0.05的蛋白質峰認為差異具有統計學意義。教師評職稱論文發表

　　2 結 果

　　通過SELDI�睺OF�睲S質譜儀對結合在蛋白質芯片上的血清標本蛋白質進行檢測，獲得34例霍奇金淋巴瘤患者和21例正常對照血清蛋白質指紋圖譜(圖1)。比較分析18例初診HL和16例化療后HL患者的血清蛋白質指紋圖譜，發現兩組間差異表達31個蛋白質M/Z，其中有25個蛋白質在化療后HL血清高表達，有6個蛋白質低表達(表1，圖2)。16例化療后HL與21例正常對照的蛋白質峰相對比，發現5個M/Z相同的蛋白質，通過統計學分析發現M/Z為2 053、2 091和4 158蛋白質與正常對照比較差異無統計學意義(表2)。圖1 霍奇金淋巴瘤患者血清蛋白指紋圖譜表1 初診和化療后HL患者血清蛋白質峰值圖2 初診和化療后霍奇金淋巴瘤患者差異血清蛋白質峰直方圖表2 化療后患者和正常對照血清蛋白質峰

　　3 討 論

　　霍奇金淋巴瘤是一種淋巴細胞和(或)組織細胞惡性增殖性疾病。有資料顯示HL的發病受社會經濟狀況影響[3]。HL分期主要采用Ann Arbor分期方案，療效標準采用1989年英國Cotswold會議的報告，但均有很大的主觀性。凌家瑜等[4]認為應用SELDI�睺OF�睲S分析，可在化療前后篩選出非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者血清中的標志蛋白，有可能在微小殘留病檢測、早期復發預測、療效判斷等方面提供有用的信息。Zhang等[5]應用該技術發現M/Z為10 197.91的蛋白質在NHL血清中顯著升高，并且在不同的國際預后指數(IPI)評分或乳酸脫氫酶水平患者間也有差異，認為有可能是檢測NHL治療反應和評價預后的新的血清學生物標記。

　　本實驗發現化療前后HL血清蛋白質指紋圖譜之間有31個差異蛋白質峰，其中25個蛋白質在化療后HL血清中高表達，6個蛋白質低表達，我們認為化療后高表達的蛋白可能是正常細胞所表達，化療前被淋巴瘤細胞抑制，而低表達的蛋白可能是淋巴瘤細胞所表達，化療后低表達與化療藥物應用后瘤細胞負荷減少有關，它們可能是HL療效觀察和多藥耐藥性(MRD)的血清標志物。25個高表達的蛋白質中，14個M/Z在2 000～5 000，9個在5 000～10 000，2個大于10 000;6個低表達的蛋白質中M/Z大于10 000的有2個，小于10 000的有4個，可見與化療有關的血清蛋白質可能主要是中小分子質量蛋白質或多肽。同時我們發現M/Z為2 053，2 091和4 158的蛋白質與正常對照沒有統計學差異，可能是對化療最敏感的血清蛋白質標志物中的3個。通過http://us.expasy.org/tools/tagident.html在蛋白質數據庫中搜索發現，31個差異蛋白質峰中，M/Z為11 449和8 183蛋白質峰對應的蛋白質分別是生長蛋白抑制因子��3和線粒體基因組必須蛋白��2類似物。生長蛋白抑制因子��3由p47ING3基因編碼，是ING基因家族成員。Nagashima等[6]研究發現生長蛋白抑制因子��3在包括脾臟、睪丸、骨骼肌和心臟在內的一些正常人類組織和器官中有較高表達水平，在不同癌細胞系有不同的表達水平。他們認為p47ING3基因調節p53介導的轉錄、細胞周期調控和凋亡。線粒體基因組必須蛋白��2是缺乏線粒體基因組細胞生長的必須蛋白，分子功能尚不明確，而蛋白MGR2同系物屬于MGR2家族，位于生物膜上的單次穿膜蛋白，其功能可能與MGR2相似。但兩種蛋白質均需要進一步證實。

　　本研究結果表明，應用SELDI�睺OF�睲S可篩選HL患者血清中的標志蛋白，可能在HL患者診斷、分期、MRD檢測、療效判斷、早期復發預測等方面提供有價值的信息。

【參考文獻】
  　[1] 申衛紅，劉 慧，彭 鑫，等.強力霉素抑制絲裂霉素誘導的MTEC1細胞凋亡及其蛋白質組初步分析[J].江蘇大學學報：醫學版，2009，19(3)：197-201.

　　[2] 周靖泳，韓麗英.表面加強激光解析電離飛行時間質譜技術在血液系統疾病中的應用[J].醫學綜述，2007，13(24)：1941-1943.

　　[3] Clarke CA, Glaser SL, Keegan TH, et al. Neighborhood socioeconomic status and Hodgkin′s lymphoma incidence in Califormia[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2005，14(6)：1441-1447.

　　[4] 凌家瑜，孫曉非，張 星，等.非霍奇金淋巴瘤患者化療前后血清蛋白質譜動態變化及其標志蛋白的篩選[J].癌癥，2008，27(10)：1065-1069.

　　[5] Zhang MZ, Sun ZC, Fu XR，et al. Analysis of serum proteome profiles of non�睭odgkin lymphoma for biomarker identification[J]. J Proteomics，2009，72(6)：952-959.

　　[6] Nagashima M, Shiseki M, Pedeux RM, et al. A novel PHD�瞗inger motif protein, p47ING3, modulates p53�瞞ediated transcription, cell cycle control, and apoptosis[J]. Oncogene, 2003, 22(3)：343-350.教師評職稱論文發表