羊軟骨Ⅱ型膠原蛋白的提取純化與鑒定

【摘要】  目的 從羊肋軟骨中提取純化Ⅱ型膠原蛋白，并對其進行鑒定。方法 選擇羊肋軟骨為原料經脫脂、脫鈣后，用鹽酸胍去除蛋白多糖，經胃蛋白酶消化、氯化鈉鹽析等步驟，提取純化蛋白，然后進行鑒定。結果 4mol/L鹽酸胍能有效去除蛋白多糖，用胃蛋白酶的限制性酶解結果滿意；氯化鈉鹽析濃度為3mol/L時最佳。SDS-PAGE電泳結果顯示提取純化的蛋白與Sigma公司的Ⅱ型膠原蛋白一致。Ⅱ型膠原蛋白最大吸收峰為212 nm。結論 從羊肋軟骨提取的Ⅱ型膠原蛋白純度高，且符合II型膠原蛋白的特征。

【關鍵詞】  Ⅱ型膠原蛋白；軟骨；蛋白多糖管理論文發表

　　Abstract: Objective  To isolate and purify collagen typeⅡ(CⅡ) from Sheep cartilage and to identify its purity.  Methods  The Sheep cartilages were collected as raw materials. After degreasing and decalcification, Guanidine hydrochloride was used to remove the proteoglycans. The digestion of pepsin, salting of sodium chloride were performed for extracting CⅡand identification. Results  The proteoglycans could be efficiently removed by 4mol?L��1 guanidine hydrochloride. The results were obtained by limited enzyme digestion of pepsin added. The optimizing concentration of sodium chloride for salting CⅡwas 3mol?L��1. It was found that the protein and Sigma CⅡ were at the same location by SDS�睵AGE. The absorption peak was at 212nm. Conclusion  The CⅡ isolated from Sheep cartilage has high purity and accords with the characteristics of Collagen typeⅡ.

　　Key words: collagen typeⅡ; cartilage; proteoglycans

　　Ⅱ型膠原蛋白(collagen typeⅡ，CⅡ)是軟骨基質的主要有機成分，是關節軟骨中主要的細胞外間質之一。近年來研究表明，類風濕性關節炎的發病與CⅡ自身免疫反應有關［1-3］，口服CⅡ誘導免疫耐受對類風濕性關節炎(Rheumatoid Arthritis，RA)有顯著的療效［4］。對于膠原蛋白的提取目前所報道的方法，操作復雜，條件不一，結果存在很大的差別［5-8］。本研究選擇寧夏富有的綿羯羊肋軟骨為原料，來制備較高純度的Ⅱ型膠原，報告如下。

　　1  實驗材料和方法

　　1. 1  主要試劑和耗材

    胃蛋白酶(Amresco 公司)；鹽酸胍（Amresco 公司）；牛Ⅱ型膠原蛋白參照品(C7806 Sigma公司)；46～200 kD蛋白質分子量標志物(寶生物工程有限公司)，陰離子交換載體(DEAE32 上海試劑二廠)，透析袋（德國 Serca Feinbiochemica公司），余試劑均為國產分析純。

　　1. 2  主要儀器

      電泳儀(Bio-Rad公司)；凝膠全自動圖像分析系統(Bio-Ra公司)；冷凍離心機(日立公司 CF16RX)；酸度計(梅特勒-托利多儀器有限公司)；電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；721分光光度計(Varian公司)；LL-3000型冷凍干燥機（Thermo Electron Corporation）。

　　1.3  方法

　　1.3.1  膠原蛋白的提取

　　從新鮮的羊肋軟骨中切取透明軟骨，剝去骨膜，去除骨化部分，用生理鹽水洗凈，切成0.5mm左右的薄片，液氮冷凍粉碎后稱重，按照軟骨量加入5倍體積的脫脂液(氯仿∶甲醇∶水=1∶2∶0.8)在4℃下攪拌脫脂48h，期間每8h更換脫脂液直到脫脂完全，在同樣溫度和攪拌條件下用10倍體積的0.lmol/L鹽酸進行脫鈣處理48h，直到軟骨變柔軟，離心去除脫鈣液，按照每克軟骨加入10倍體積的4mol/L鹽酸胍，于4℃攪拌48h，12000g離心20 min，沉淀用Tris-HCl（pH7.4）緩沖液和0.5mol/L乙酸充分洗滌后，用5倍體積的胃蛋白酶消化液(0.5mol/L乙酸配成1g/L)混懸，4℃下攪拌24h，12000g離心30 min，收集上清液；沉淀再加5倍體積的胃蛋白酶消化液重復酶解一次，離心收集上清液。混合兩次上清液，用5 mol/L NaOH迅速調節上清液至pH 7.4。加入氯化鈉（NaCl）使其濃度為3 mol/L，4℃鹽析過夜，離心得到上清液和沉淀A1。調NaCl濃度至4 mol/L時，4℃鹽析過夜，離心得到上清液和沉淀A2。取沉淀A1用0.1mol/L乙酸溶解，2mol/L NaOH中和至pH 7.4，分別再用0.05mol/L Tris-HCl(pH 7. 4)、蒸餾水進行透析平衡后，即得膠原初提液S1。

　　1.3.2  陰離子交換樹脂(DEAE32)的預處理

　　DEAE-32經過溶脹、酸處理、堿處理后，用去離子水平衡至中性，處理好的離子交換載體置于4℃冰箱冷卻備用。

　　1.3.3  蛋白批量離子交換

　　將蛋白初提液S1和3倍體積的Tris-HCl（pH7.4）緩沖液混合后，置于燒杯中，加入適量用緩沖溶液平衡后的陰離子交換載體，使樹脂和蛋白溶液的體積比約為1∶5，混合均勻，緩慢攪拌120min后，12000g離心，收集上清液。于上清液中加入氯化鈉使其濃度為3 mol/L，4℃鹽析過夜，12000g離心30min，收集沉淀。將沉淀用0.1mol/L乙酸溶解，分別再用0.05mol/L乙酸、0.01mol/L乙酸、蒸餾水進行透析平衡后，得膠原溶液，用冷凍干燥機冷凍干燥16h，收集蛋白凍干粉。

　　1.3.4  SDS-PAGE電泳檢測 管理論文發表

　　將自提純化的蛋白和牛Ⅱ型膠原蛋白參照品均配成0.01g/L蛋白溶液。濃縮膠濃度3% (pH 6. 8)，分離膠濃度8% (pH 8. 8)，電壓140 V，電泳時間3h，結束后，凝膠用考馬斯亮藍染色30min，脫色后用凝膠全自動圖像分析系統進行圖像分析。

　　1.3.5  吸收光譜測定

　　用分光光度計在波長180～500 nm范圍進行掃描，掃描條件如下：紙速80mm/min，掃描速度180mm/min。

　2  結果

　　2.1  蛋白分子量的測定

　　在鹽析時，當NaCl濃度為3mol/L時，得到大量蛋白沉淀A1；當將NaCl濃度調至4mol/L時，得到的沉淀A2很少。將沉淀A1和A2經過脫鹽、透析處理后，進行SDS-PAGE電泳分析，電泳圖譜見圖1。A1在電泳圖譜上所表現與Sigma公司的牛Ⅱ型膠原蛋白參照品一致，分子量約為130 kD；A2為小分子蛋白主要在60-90 kD之間，見圖1。

　　2.2  纖維素純化的效果

　　蛋白初提液S1經陰離子交換樹脂(DEAE32)的處理后，進行SDS-PAGE電泳分析，與處理前比較未見明顯變化，見圖2。

　　2.3  提取的蛋白吸收光譜分析

　　從圖3可看出提取的蛋白吸收峰為212 nm，符合CⅡ的吸收光譜［9］。

　　3  討論

    Ⅱ型膠原是RA的一種自身抗原，抗膠原抗體和膠原特異性T細胞在關節炎的發生和發展中起重要作用，口服同種屬或異種屬Ⅱ型膠原均有抑制、減輕動物模型關節炎的作用。鑒于寧夏羊軟骨來源豐富，我們采用酶消化法來提取羊Ⅱ型膠原蛋白。 圖3  羊軟骨Ⅱ型膠原蛋白吸收光譜

    Ⅱ型膠原分子間交聯鍵的存在使其分子穩定性增加，這是膠原提取的主要困難。本研究采用胃蛋白酶降解法，去除部分伸直端尾肽，螺旋結構不受影響，故仍保持Ⅱ型膠原分子完整性，抗原性基本不受影響。由于關節軟骨中含有大量的蛋白多糖，這些物質的存在直接影響純化質量，鹽酸胍溶解可有效去除大量的蛋白多糖，DEAE陰離子交換又進一步去除蛋白多糖［10-11］。本實驗結果提示4mol/L鹽酸胍能有效去除蛋白多糖等雜質；并對NaCl為3mol/L時的離心沉淀用0.5mol/L乙酸溶解，再用DEAE32進行純化，SDS-PAGE電泳未觀察到處理前后的明顯變化。本研究對所提取的Ⅱ型膠原鑒定結果表明：①SDS-PAGE電泳與Sigma公司的樣品完全一致，分子量約為130 kD。②吸收光譜分析顯示提取的蛋白紫外最大吸收峰在212 nm處，符合Ⅱ型膠原的特征。所以此提取、純化方法簡單易行，并且可以工業化生產，為羊軟骨CⅡ提取提供了實驗方法和便利條件。

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