瘦素基因啟動子G-2548A多態性與青年高血壓的相關性研究

【摘要】  目的 探討瘦素基因多態性與青年人高血壓的相關性。方法 采用PCR-RFLP技術對98例青年高血壓患者、105例青年血壓正常者和86例老年高血壓者的瘦素基因G-2548A位點多態性進行研究，并分析比較三組人群該基因基因型及等位基因的分布。 結果 青年高血壓組AG/GG基因型頻率和G等位基因頻率明顯高于青年正常對照組(P<0.05);青年高血壓組AG/GG基因型頻率和G等位基因頻率明顯高于中老年高血壓病例組 (P<0.05)。結論 青年高血壓組G等位基因頻率明顯高于青年正常組和中老年高血壓組，瘦素基因啟動子G-2548A多態性可能與青年人高血壓存在關聯。

【關鍵詞】  高血壓;青年人;瘦素基因;多態性

　原發性高血壓是影響冠心病、中風、腎臟等疾病發病和死亡的重要危險因素[1-2]。近年來人群高血壓患病率逐年升高并呈現發病年齡提前的趨勢，本研究分析瘦素基因(leptin gene,LEP)多態性與青年高血壓的相關關系，將從分子生物學水平探討遺傳背景對原發性高血壓,特別是早發原發性高血壓的影響，并通過現場調查提高青年人群對高血壓的認識，為早期預防控制和治療高血壓提供依據和指導。

　　1 對象與方法

　　1.1 對象

　　研究對象均來自2006-2008年開展的寧夏地區人群慢性病相關因素調查中自愿采血的人群。青年高血壓組98例，其中男45例，女53例，年齡(37.38±6.29)歲;青年血壓正常組105例，年齡(35.95±5.06)歲;中老年高血壓組86例，年齡(59.08±4.00)歲。高血壓判斷標準：采用1999年WHO/ISH確定的標準將收縮壓(SBP)≥140mmHg和(或)舒張壓(DBP)≥90mmHg或調查時血壓正常但既往有高血壓病史且正在服用降壓藥者均診斷為高血壓。世界衛生組織于2000年提出了新的年齡劃分法：45歲以下為青年，45～59歲為中年，60～74為年輕的老人或老年前期，75～89歲為老年，90歲以上為長壽老人。核心論文發表網

　　1.2 基因多態性分析方法 收集EDTA抗凝血3mL，采用酚/氯仿法提取基因組DNA，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術檢測瘦素基因啟動子區G-2548A位點多態性。PCR擴增引物根據文獻[3]設計，由北京奧科生物公司合成;上游引物：5'-TTT CCTGTA ATT TTC CCG TGA G-3'，下游引物：5'-AAAGCA AAG ACA GGC ATA AAA A-3'。PCR擴增體系為50μL，包括模板DNA 5μL，上、下游引物各1.5μL (0.30μmol·L-1)，dNTP 4μL (200μmol·L-1)，10×buffer 5μL,Taq酶(天津天根生物公司) 1μL(2.5μmol·L-1)。應用BIO-RAD全自動基因擴增儀擴增目的片段。反應條件為：94℃5min， 94℃45s，52.6℃45s，72℃45s,循環30次,最后72℃延伸7min。擴增產物為242bp經HhaI限制性內切酶(promega公司)37℃消化6h,消化產物(瘦素基因擴增產物12μL, 10×Buffer 2.0μL, HhaI限制性內切酶0.5μL, BSA 0.2μL，ddH2O 5.3μL, 總體積20μL)經2%的瓊脂糖凝膠電泳及溴化乙啶染色鑒定�；�因型判斷：在瘦素基因5' 端末翻譯區2548位存在G→A的多態性，2548位為G等位基因時存在HhaI限制性內切酶酶切位點，而為A等位基因時該酶切位點消失。因此，當瘦素基因型為GG時，兩個等位基因均有切點，酶切產物電泳后有181bp和61bp兩條帶;AA基因型時，兩個等位基因均無切點，酶切產物電泳后為242 bp一條帶;AG基因型時，一個等位基因有切點，另一個等位基因無切點，酶切產物電泳后為242 bp、181bp和61bp三條帶，見圖1(封3)。

　　1.3 統計學方法 統計分析使用SPSS 11.5軟件包。χ2吻合度檢驗各組基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡法則,基因型及等位基因頻率差異比較采用χ2檢驗。

　　2 結果

　　2.1 青年高血壓病例組與青年正常對照組瘦素基因基因型及等位基因分布頻率的比較 見表1。

　　經吻合度檢驗,青年高血壓組、青年正常對照組兩組基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡法則(P>0.05)。經卡方檢驗,兩組間AA和AG/GG基因型分布差異有統計學意義(χ2=6.530，P=0.011),等位基因在兩組的分布頻率差異有統計學意義(χ2=8.262，P=0.004)。青年高血壓組AG/GG基因型頻率(46.9%)和G等位基因頻率(28.6%)明顯高于青年正常對照組的(29.5%)和(16.7%)。表1 青年高血壓病例組與青年正常對照組LEP基因型及等位基因分布頻率的比較

　　組別基因型/%AAAG+GG等位基因/%AG青年高血壓組52(53.1)46(46.9)140(71.4)56(28.6)青年正常組74(70.5)31(29.5)175(83.3)35(16.7)χ2值6.5308.262P值0.0110.0042.2 青年高血壓病例組與中老年高血壓病例組LEP基因型及等位基因分布頻率的比較 見表2。

　　經吻合度檢驗, 青年高血壓組、中老年高血壓病例組兩組基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡法則 (P>0.05) 。經卡方檢驗, 兩組間 AA 和AG/GG 基因型分布差異有統計學意義(χ2= 7.970, P=0.005),等位基因在兩組的分布頻率差異有統計學意義(χ2= 9.577,P=0.002)。青年高血壓組AG/GG基因型頻率(46.9%)和G等位基因頻率(28.6%)明顯高于中老年高血壓病例組的(26.7%)和(15.1%)。表2 青年高血壓病例組與中老年高血壓病例組LEP基因型及等位基因分布頻率的比較

　　組別基因型/%AAAG+GG等位基因/%AG青年高血壓組52(53.1)46(46.9)140(71.4)56(28.6)中老年高血壓組63(73.3)23(26.7)146(84.9)26(15.1)χ2值7.9709.577P值0.0050.0023 討論

　　人類瘦素基因位于人染色體7q31,是限制食物攝入和增加能量消耗的信號分子[4]。2002年有研究首次發現瘦素基因啟動子區 G-2548A 突變與肥胖有關，并分析得出該多態性增加了瘦素基因的表達和脂肪瘦素的分泌[5]。因此隨著瘦素基因功能的明確，廣泛的研究證實了瘦素基因多態性與肥胖、糖尿病、心血管等疾病的關聯[6-7]。同時多人研究得出瘦素基因多態性與血壓及高血壓相關聯[8-9]，并有研究發現瘦素基因與高血壓的關聯性是獨立于肥胖因素的[10]。
　本文以瘦素基因 G-2548A 變異為標記，探討寧夏地區青年人群中瘦素基因的變異與高血壓易感性的關系。發現青年高血壓患者和正常對照之間，瘦素基因啟動子 G-2548A 多態性分布存在差異，其中青年高血壓患者 AA+ AG 基因型頻率和 G 等位基因的頻率較對照組明顯增高(P均<0.05)，因此，瘦素基因啟動子 G-2548A 多態性與高血壓密切相關，G等位基因可能是高血壓發病的遺傳易感因素。同時我們還比較了高血壓病例組內不同年齡結構人群中瘦素基因啟動子 G-2548A位點基因型和等位基因頻率,發現青年患者中的AA+AG基因型及G等位基因頻率要顯著高于老年患者(P<0.05) ，表明G等位基因在促進原發性高血壓早期發生方面的作用不容忽視。

　　高血壓流行病學資料表明,我國原發性高血壓的發病率逐年升高,并且其起病年齡也日趨年輕化[11],其根本原因尚不清楚。原發性高血壓是環境因素參與下的多基因遺傳性疾病[12],而早期發病現象是遺傳性疾病的共同特點。青年原發性高血壓患者作為一個重要的群體,越來越受到廣大研究者的重視。隨著遺傳性關聯分析和連鎖分析方法的應用,以及轉基因高血壓動物模型的實驗成功,目前深入研究基因與原發性高血壓的關聯性已經成為目前該病病因學研究的主要方向。本研究發現該多態性與早發原發性高血壓存在緊密的聯系,瘦素基因 G-2548A AG+GG基因型及G等位基因明顯增加了青年人群罹患原發性高血壓的危險性,并促進原發性高血壓的早期發生。我們認為,對該位點基因多態性的檢測將有助于闡明早發原發性高血壓的遺傳本質和發病機制,將會對高血壓的臨床分型、預后判斷、個體化治療和易感人群的早期檢出及預防產生重要影響。

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