組織芯片技術探討ERK1和p16在胃腸間質瘤中的表達及意義

【摘要】  目的： 應用組織芯片技術探討細胞外信號調節激酶1（ERK1）與p16在胃腸間質瘤中的表達情況及兩種蛋白間的相關性。 方法： 采用免疫組化Maxvision法檢測40例胃腸間質瘤和40例正常對照組中ERK1和p16的表達情況。 結果： ERK1在胃腸間質瘤組中的表達水平高于正常對照組，而p16表達情況相反（P＜0.032)；未發現ERK1與p16之間有明確相關關系。 結論： ERK1與p16可能參與了胃腸間質瘤的發生、發展過程；組織芯片技術可用于大規模高效檢測臨床樣本，具快速、方便、經濟、準確的特點。

【關鍵詞】  胃腸間質瘤； 細胞外信號調節激酶1； p16； 組織芯片

    ［Abstract］  Objective: To investigate the expression and correlation between extracellular signal�瞨egulated kinase(ERK1) and p16 in gastrointestinal stromal tumor  by tissue chip. Methods： The expressions of ERK1 and p16 were examined by  the maxvision method in 40 GISTs and 40 normal in contrast group. Results： The expression of ERK1 was higher in  GISTs than in the contrast group, while the expression of p16 was higher in the contrary. There was no obvious relation between ERK1 and p16.  Conclusion： ERK1 and p16 may play a role in the development of GIST; the tissue chip is convenience, economic and reliable in large amount of testing samples.

    ［Key words］  gastrointestinal stromal tumor;  ERK1;  p16;  tissue chip

    胃腸間質瘤（gastrointestinal stromal tumor, GIST）是源于消化道最常見的間葉組織腫瘤，多數特異性表達CD117蛋白（c�瞜it受體，干細胞生長因子受體）。目前研究認為GIST的發生與c�瞜it基因突變有關，該基因突變后，引起細胞內信號轉導改變而導致細胞存活、增殖與分化［1］。CD117突變后，可通過一系列大分子相互作用引起級聯反應。目前研究最多的是RTK�睷AS�睲APK途徑。細胞外信號調節激酶（extracellular signal�瞨egulated kinase，ERK）通路是MAPK中的通路之一。ERK通路是受外界刺激時決定細胞命運的關鍵性因素，它的活化是將信號從表面受體轉導至核的關鍵步驟，其持續性活化最終促進了細胞的不斷增殖和轉化［1］。 腫瘤的發生是一個多因素多步驟的過程，除原癌基因的激活外，腫瘤抑制基因的失活也起著重要的作用。p16基因又稱多腫瘤抑制基因（multiple tumor suppressor I，MTS�睮），對正常細胞周期具有調控作用，主要通過與細胞周期素D（cyclin D）競爭性結合細胞周期素依賴性激酶4或6（CDK4/6），并抑制其功能，使Rb保持低磷酸化或非磷酸化的活性狀態，阻止細胞從G1期進入S期，抑制細胞的無限增殖［3］。有學者研究發現GIST中存在9號染色體缺失，認為這可能和GIST的惡性轉化有關［4］。本研究采用組織芯片技術分析ERK1和p16在胃腸間質瘤中的表達，進一步探討其在該腫瘤中的可能發病機制及意義，為臨床研究提供一定的理論資料。醫學職稱論文發表

    1  材料與方法

    1.1   材  料

    收集南昌大學第一附屬醫院病理科、江西省腫瘤醫院病理科、江西省人民醫院病理科2004年9月～2005年10月間手術切除標本，經兩名以上有經驗的病理專家結合臨床、大體、鏡下和免疫組化結果診斷為胃腸間質瘤病例40例。根據WHO2000消化系統腫瘤分類及文獻［5］分為低度危險組11例、中度危險組11例、高度危險組18例；并以40例取自胃腸道腫瘤大體標本腫瘤遠端肌層組織作為正常對照組。所有標本均經甲醛固定，常規石蠟包埋、切片。40例標本來源患者中男性19例，女性21例。

    1.2  主要試劑

    兔多克隆抗體ERK1，工作濃度1∶100，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；鼠抗人單克隆抗體p16/MIS1，即用型快速免疫組化Maxvision檢測試劑盒均購自福州邁新生物技術有限公司。

    1.3  實驗方法

    胃腸間質瘤組織芯片的構建和制備:將收集的40例胃腸間質瘤和40例正常對照標本制成組織芯片。組織芯片的基本制作過程：①芯片的設計；②根據設計將受體蠟塊進行打孔，孔徑大小與供體組織鉆取孔徑大小一致；③對供體組織HE切片作形態學觀察并在供體蠟塊上準確標記所需要的靶點；④利用打孔儀鉆取靶點組織，并轉移至受體蠟塊相應的孔位上，制成所需的陣列蠟塊。

    將制成的組織芯片制成4 μm切片，常規脫蠟水化；3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶；高溫蒸汽輔助檸檬酸緩沖液抗原修復（CD117抗體為EDTA緩沖液修復）約5 min；滴加一抗，室溫下孵育60 min；PBS漂洗，滴加即用型MaxvisionTM試劑，室溫下孵育15 min；DAB顯色，蘇木素染胞核，鹽酸乙醇分化、脫水透明，中性樹膠封片。

    1.4  結果判斷

    ERK1以細胞結構呈明確的棕黃色尤其是核內出現棕黃色顆粒為細胞陽性染色。ERK1以陽性細胞數＜30％為陰性，陽性細胞數≥30％為陽性［6］。p16以細胞質和細胞核內出現棕黃色顆粒為細胞陽性，僅細胞質或細胞核著色，以及顯色強度與背景無差別為陰性。p16于5個高倍鏡視野（×40）中，各計數100個細胞，按切片中陽性細胞的比例劃分，陽性細胞數＞10％為陽性［7］。

    1.5  統計學方法

    本資料屬于計數資料，用SPSS11.5軟件處理。首先采用χ2檢驗，比較在GIST組和對照組中ERK1,p16的表達水平有無差異；若有差異，則進一步用行×列表資料的χ2檢驗分析實驗組內低、中、高度危險組中ERK1,p16表達有無差異；若有差異則用χ2分割法來兩兩比較這3組之間的差異。以雙側P＜0.05，單側P＜0.032為有統計學意義。

 2  結  果

    2.1  胃腸間質瘤組與正常對照組中ERK1與p16的比較

    ERK1以核內出現棕黃色顆粒為陽性染色。p16以細胞質和細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性表達（圖1）。40例GIST中有24例ERK1表達陽性，12例p16表達陽性，與對照組中兩種蛋白表達的差異有統計學意義（P<0.032）(表1)，表明ERK1和p16參與了GIST的發生發展過程。表1  GIST組與對照組中ERK1與p16的表達情況

    2.2  不同級別胃腸間質瘤中ERK1與p16比較

    本次研究未發現ERK1和p16在不同級別GIST組中表達存在統計學差異（P>0.05）（表2，3）。表2  不同級別GIST中ERK1和p16的表達情況表3  低、中度組合并后ERK1和p16的表達情況

    2.3  胃腸間質瘤中ERK1,p16之間的相關性

    對40例GISTs中ERK1和p16之間的表達關系進行線性相關分析，r=0.274,P>0.05，未發現兩者之間有明確的相關性。

    3  討  論

    人們認為異常的細胞信號轉導系統對促進惡性腫瘤的形成起到了至關重要的作用［8］。其中酪氨酸激酶系統也許是細胞調控當中最關鍵的分子信號系統之一［9］。現已證實大部分GIST中存在c�瞜it基因的突變。突變后的KIT受體持續性活化，其下游的RAS蛋白也被活化，活化的RAS激活一個重要的通路絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）通路。MAPK通路是真核細胞介導細胞外信號到細胞內反應的重要信號轉導系統，調節著機體細胞的生長、分化、分裂、死亡以及細胞間的功能同步化等多種過程［10］。在真核細胞中已確定MAPK有4條信號通路，其中了解得最為清楚的一條是ERK通路。ERK通路包括ERK1（p44MAPK）和ERK2（p42MAPK）通路，兩者功能相似。ERK是受到外界刺激時決定細胞命運的關鍵性因素，它能促進增殖，決定細胞向終末期分化或發生凋亡。ERK的活化是將信號從表面受體轉導至核的關鍵步驟，其持續性活化最終促進了細胞的增殖和轉化［1］。本實驗觀察到ERK1在GIST組中的表達水平高于對照組中的表達水平，且差異有統計學意義，表明ERK1參與了GIST的發生發展過程。我們未發現ERK1在不同級別GIST中的表達差異，這與某些文獻報道較一致［11］。醫學職稱論文發表

    p16基因位于人9p21，又稱多腫瘤抑制基因I（multiple tumor suppressor I, MTS�睮），其編碼產物p16蛋白，是細胞周期的有效調控者，又是抑制腫瘤細胞生長的關鍵因子［12］。

    在人類多種腫瘤中發現p16基因異常，表現為缺失或突變。其表現特點以基因缺失為主，且多為純合子丟失。不同腫瘤突變頻率不同，同一腫瘤的不同分化程度其缺失和突變率也不同。關于p16基因在GIST形成中的作用，眾多學者的研究認為p16基因參與了GIST的發生、發展。本實驗研究觀察到p16在GIST組中的表達水平高于對照組中的表達水平，且差異有統計學意義，表明p16參與了GIST的發生發展過程。我們未發現p16在不同級別GIST中的表達差異，這與某些文獻報道較一致［11］。

    理論上，ERK通路活化可使胞內cyclin D合成增多。而p16則通過與cyclin D競爭，結合并抑制CDK4/6，使之不能解除Rb基因對轉錄因子的抑制，從而抑制細胞增殖，阻止細胞生長。在正常的細胞周期中，細胞的增殖與抑制是受到精密調控的。但是在致瘤因子的長期刺激下，ERK通路被持續性活化，細胞處于不斷的分裂增殖狀態。細胞內高水平表達的cyclin D及cyclin    D�睠DK4/6復合物也將刺激p16基因的表達，競爭性抑制CDK4/6的活性。然而，p16基因是腫瘤中目前所知最常發生改變的基因，主要表現為缺失或突變或甲基化而失活。導致p16基因發生突變的原因未明，而ERK與p16之間的關系目前也無統一的觀點。有的認為ERK信號通路活化可誘導p16等抑癌基因表達，有的發現ERK通路活化常伴有p16基因缺失，而有的則認為ERK通路活化與p16表達間無明確聯系。本實驗未觀察到ERK1與p16之間有何明確的關系，這與某些文獻報道不一致，可能與收集標本數有限有關。兩者之間的關系有待進一步實驗證實。

    本研究采用組織芯片技術研究GIST中ERK與p16的表達情況，并初步探討其意義。組織芯片特點是體積小，信息含量大，一次性實驗即可獲大量結果，可做HE染色、特殊染色、免疫組織化學染色、DNA和RNA原位雜交、熒光原位雜交。組織芯片蠟塊可做100～200張連續切片，這樣用同一套組織芯片即可迅速地對上百種生物分子標記（如抗原、DNA和RNA）進行分析、檢測，因而備受組織病理學家的重視。我們制作了80例GIST的組織芯片，其中GIST40例，正常消化道管壁肌組織40例。每張組織芯片上樣品排列整齊，外形為圓形或類圓形，較少有皺折和掉片現象。僅用幾張芯片即完成了全部實驗，極大地節約了研究經費并降低了勞動量，在最短的時間內獲得了GIST中ERK1和p16 K表達的全部數據。因此，應用組織芯片大規模高效檢測臨床組織樣本是可行的，具有快速、方便、經濟、準確的特點。

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