脊髓損傷后軸突再生抑制分子對RhoA的影響

【關鍵詞】  脊髓損傷； RhoA； 軸突抑制分子

20世紀80年代，Richardson等［1］發現脊髓損傷后軸突很難再生,主要是由于軸突周圍環境中存在抑制分子，而不是軸突本身失去再生能力。目前已有共識認為軸突再生同時受到損傷后的細胞外基質分子和細胞內因子的共同調節。生長抑制蛋白被認為是抑制軸突再生的最主要原因［2］，它們通過影響細胞內一種小GTPase�睷hoA信號通路來抑制神經軸突的生長。現將有關這方面的研究進展做簡要綜述。

    1  軸突再生抑制分子

    脊髓損傷后，在損傷區域開始出現大量不同的軸突生長抑制物質，這些生長抑制物質大致可分為3類：髓磷脂相關抑制物、膠質瘢痕起源的抑制物、斥性軸突導向分子（repulsive axon guidance molecules,RGM)。

    1.1  髓磷脂抑制分子

    自髓磷脂相關抑制物被證實是早期軸突再生失敗的主要原因以來，已發現3種最具特征的抑制分子［3］，包括軸突生長抑制因子（neurite outgrowth inhibitor�睞,Nogo�睞）、髓鞘相關糖蛋白（myelin associated glycoprotein,MAG）、少突膠質細胞髓鞘糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp）。

    Nogo�睞是存在于中樞神經系統髓磷脂中的一種跨膜蛋白質，主要由少突膠質細胞表達，近年來發現在神經元中也檢測到Nogo�睞［4］。它有兩個與軸突抑制相關的結構域，其中胞外結構域含有一個有潛在效應的66�舶被�肽（Nogo��66），并且這個胞外結構域也存在于Nogo�睟和Nogo�睠中。Nogo�睞在中樞神經系統包括少突膠質細胞損傷時直接暴露于軸突。另一個是胞內結構域，位于Nogo�睞的胞內氨基末端部分，是Nogo�睞所特有的，少突膠質細胞損傷時就暴露于Nogo�睞的胞內區域。盡管Nogo�睞在生理和病理的作用尚未明確，但Nogo��66a已被廣泛應用。

    MAG是免疫球蛋白超家族中的一種跨膜蛋白質，在中樞神經系統和外周神經系統髓鞘中均有分布，它具有黏性，主要由少突膠質細胞表達，位于軸旁周的膜上，理論上能與軸突相互作用［5］。MAG的一個突出的特征是神經元在一定的狀態下具有調節軸突雙向生長的能力，能促進幼小神經元的軸突生長［6］。

    OMgp是一種糖基磷脂酰肌醇（GPI)錨定膜蛋白，由少突膠質細胞表達，最近發現在體外誘導能引起生長錐塌陷，并抑制軸突生長［7］。OMgp被認為是一種重要的髓磷脂抑制分子。

    1.2  膠質瘢痕起源的抑制物研究生論文發表

    脊髓損傷后引起神經膠質反應性增生，活化的星形膠質細胞和少突膠質細胞分泌多種硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPGs），主要存在于胞外基質，包括神經蛋白聚糖（neurocan），磷酸肌酸蛋白聚糖（phosphacan），Brevican等，也有其他膠質細胞分泌的多功能蛋白聚糖(versican)，NG2（NG2�瞘lia)等。CSPGs包含核心蛋白和以共價鍵相連的硫酸軟骨素和氨基側鏈，在中樞神經系統發育過程中可調節細胞增生、遷徙和分化，但在脊髓損傷后，CSPGs 表現出強大的抑制作用，抑制軸突和神經細胞的再生修復［8］。

    1.3  排斥性軸突導向分子

    RGM是含有GPI附著點的內源性抑制蛋白，包括semaphorins（Sema）、ephrins、netrins、slits等［9，10］。這些分子在軸突和樹突的發育中發揮著重要的作用。在體外實驗中，RGM能引起雛雞顳側的視網膜神經細胞生長錐塌陷，并能引導顳側視網膜軸突生長［11，12］。它們在中樞神經系統中的持續表達預示著還有其他的作用，已有研究者在海馬中檢測到semaphorins3和semaphorins4的表達，提示其在突觸可塑性上有重要作用［13］。在脊髓損傷后，皮質脊髓束和紅核脊髓束的軸突表達semaphorins3的受體，包括neuropilin1、neuropilin2和plexin A ［14］，與semaphorins3A結合引起背根神經節神經元（dorsal root ganglion neuron,DRGN）軸突抑制［15］。Ephrins是雙功能分子，與細胞表面的受體Ephs結合，發揮軸突導向的作用。其他軸突導向分子netrins和slit可能也有相同的作用，目前還在研究的早期階段。

    2  RhoA

    2.1  RhoA概述

    Rho是一種結合在胞膜內壁上的小GTP酶，分子量為20～30 KD,屬于Ras超家族系中的一類。Rho家族包括RhoA、Rac1和Cdc42等。RhoA具有與GDP結合的失活態和與GTP結合的激活態，主要受三類蛋白的調節：①鳥苷酸交換因子（guanine exchang factor,GEF），它能促進GDP/GTP交換反應，使GDP�睷hoA轉變為GTP�睷hoA。②GTP酶活化蛋白（GTPase�瞐ctivating protein,GAP），它主要是通過增加RhoGTPase的內在的GTP酶活性，使其轉為無活性的GDP結合狀態。③GDP解離抑制蛋白（guanine mucleotide dissociation inhibitor,GDI），它能抑制GDP/GTP的交換，從而抑制該家族成員的激活。p75是軸突生長的抑制因子在細胞膜的受體（Nogo receptor,NgR）的輔助因子，將細胞外的信息傳導到細胞內，當Rho�睪DI與p75結合時，RhoA即從Rho�睪DI的抑制中釋放出來，RhoA激活［16，17］。

    2.2  RhoA的作用

    Rho的激活與生長錐的潰變以及生長抑制有關。RhoA在激活狀態下，刺激了下游的Rho激酶ROCK，ROCK是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，分為兩型：ROCK�并瘢ㄓ址QRho激酶）和ROCK�并颍琑hoA與ROCK�并窠Y合，取代了ROCK的C末端自我抑制區，激活其催化區，并進一步使肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化和MLC磷酸酶磷酸化，抑制了MLC磷酸酶活性，活化MLC，促使應力纖維形成，調節actin�瞞yosin�并虻氖湛s力，從而影響肌動-球蛋白系統而導致生長錐塌陷。ROCK�并褚部勺饔糜贚IM激酶，起到以上作用［18］。

    RhoA通過調節生長錐內的細胞骨架的重組來改變神經的生長方向。RhoA影響肌球蛋白，而后者在軸突導向中的作用是通過其收縮引起軸突生長錐的回縮及塌陷來實現的［19，20］。神經生長錐內的RhoA活性的不對稱性引起生長錐轉向，可能的機制是當生長錐內一側的RhoA活性較另一側高時，絲狀偽足在RhoA活性低的一側受到的抑制較弱，延伸更快，因此生長錐朝向該側轉向［18，20］。

    3  軸突再生抑制分子激活RhoA的機制

    3.1  髓磷脂抑制分子激活RhoA的機制

    Fournier等［21］在Nogo發現一年后就找到了Nogo��66a的受體（NgR）。NgR是GPI錨定膜蛋白，在中樞神經系統神經元和軸突中均有表達［22］。用PI�睵LC(phosphatidy�瞝inositol�瞫pecific phospholipase)處理胚胎背角神經元表面的GPI錨定膜蛋白，神經元對Nogo��66的抑制信號變得不敏感，提示Nogo��66通過GPI錨定膜蛋白NgR介導而發揮抑制作用。緊接著，另外兩種髓磷脂抑制分子MAG［23］和OMgp［8］也被證實通過相同的受體NgR介導抑制信號。NgR缺乏細胞內信號轉導結構域，需要一個跨膜的協同受體介導信號傳遞。研究發現神經營養因子p75突變小鼠對三種髓磷脂NgR受體缺乏反應［24］。Wang等［25］將刪去胞內結構域的p75轉入生長于含有髓磷脂培養基的小腦顆粒神經元中,發現可引起神經元的突起生長，證明p75受體（p75NTR）可作為NgR的一個協同受體。

    目前已有證據顯示RhoA作為一種效應器介導髓磷脂抑制分子引起的抑制信號，在培養的小腦顆粒神經元中被MAG�睩c激活［24］，NgR復合物與MAG, Nogo和OMgp結合引起下游信號并導致RhoA和它的效應器ROCK的激活。p75NTR能使RhoA從Rho�睪DI中釋放出來，當p75NTR激活后，RhoA被釋放出來，并被另一個因子Rho�睪EF所激活，使RhoA從與GDP結合的失活形式轉變成與GTP結合的激活態。抑制p75與Rho�睪DI之間相互作用的短肽能減弱髓磷脂抑制軸突再生的作用，說明p75與Rho�睪DI之間的這種作用可能與髓磷脂抑制作用有關。

    3.2  硫酸軟骨素蛋白多糖激活RhoA的機制

    已有報告證實CSPGs能抑制軸突再生［26］，但 CSPGs的受體及作用機制還不清楚。NgR不是CSPGs產生效應所必需的受體，髓磷脂抑制分子的p75NTR復合受體也不是必需的，在缺失p75NTR復合受體的動物神經元中軸突再生仍受CSPGs抑制，而不受髓磷脂抑制分子抑制［27］。近年來研究認為，RhoA通路與CSPGs的抑制有關。雞胚的背根神經節神經元神經蛋白聚糖底物可以刺激GTPase家族的RhoA通路，增加RhoA�睪TP的含量，通過特殊的阻滯劑Y��27632阻滯Rho激酶ROCK后，可以減輕神經蛋白聚糖的抑制作用［28］。多功能蛋白聚糖（來自成纖維細胞的一種蛋白聚糖）在小腦顆粒神經元（cerebellar granule neurons,CGNS）中也能增加RhoA�睪TP的含量，并減少Rac1�睪TP的數量［27］。這些都能使RhoA活性增高，從而抑制軸突生長，可以推測CSPGs在一定程度上激活了RhoA。研究生論文發表

    3.3  RGM激活RhoA的機制

    在軸突導向分子傳遞信號給細胞骨架的過程中，RhoA發揮了一定的作用。不同的軸突導向分子通過各自獨特的受體傳遞信號，semaphorins 3 的受體是neuropilin 1和/或neuropilin 2,由于它缺乏細胞內信號結合區域，需與plexin A 成為復合受體，而Sema4D直接與plexin B結合。不管是semaphorins 還是ephrins引起信號傳遞導致生長錐細胞骨架的變化都是通過RhoGTPase介導的。依賴于RhoA激活的Sema4D的活性，受到RhoGEFs激活的介導，在海馬神經元及其他細胞中用Rho激酶阻滯劑Y27632能夠阻滯Sema4D介導的生長錐塌陷［29］。可見semaphorins在脊髓損傷后抑制軸突的再生，通過阻滯semaphorins可以抑制RhoA的活性，從而促進軸突再生。

 4  結  語

    軸突再生抑制分子是脊髓損傷后軸突再生的主要原因，近年來對其抑制功能的研究很多，已經發現RhoA信號通路參與了抑制軸突再生的機制。通過干預該信號通路，能夠抑制Rho的活性，已經在動物體內實驗中發現失活的Rho能促進脊髓損傷后的小鼠軸突再生及功能恢復［30］，這為今后脊髓損傷的治療提供了新的方向。

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