脊髓損傷后軸突再生抑制分子對(duì)RhoA的影響

【關(guān)鍵詞】  脊髓損傷； RhoA； 軸突抑制分子

20世紀(jì)80年代，Richardson等［1］發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后軸突很難再生,主要是由于軸突周圍環(huán)境中存在抑制分子，而不是軸突本身失去再生能力。目前已有共識(shí)認(rèn)為軸突再生同時(shí)受到損傷后的細(xì)胞外基質(zhì)分子和細(xì)胞內(nèi)因子的共同調(diào)節(jié)。生長抑制蛋白被認(rèn)為是抑制軸突再生的最主要原因［2］，它們通過影響細(xì)胞內(nèi)一種小GTPase�睷hoA信號(hào)通路來抑制神經(jīng)軸突的生長。現(xiàn)將有關(guān)這方面的研究進(jìn)展做簡要綜述。

    1  軸突再生抑制分子

    脊髓損傷后，在損傷區(qū)域開始出現(xiàn)大量不同的軸突生長抑制物質(zhì)，這些生長抑制物質(zhì)大致可分為3類：髓磷脂相關(guān)抑制物、膠質(zhì)瘢痕起源的抑制物、斥性軸突導(dǎo)向分子（repulsive axon guidance molecules,RGM)。

    1.1  髓磷脂抑制分子

    自髓磷脂相關(guān)抑制物被證實(shí)是早期軸突再生失敗的主要原因以來，已發(fā)現(xiàn)3種最具特征的抑制分子［3］，包括軸突生長抑制因子（neurite outgrowth inhibitor�睞,Nogo�睞）、髓鞘相關(guān)糖蛋白（myelin associated glycoprotein,MAG）、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp）。

    Nogo�睞是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂中的一種跨膜蛋白質(zhì)，主要由少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，近年來發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元中也檢測(cè)到Nogo�睞［4］。它有兩個(gè)與軸突抑制相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，其中胞外結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)有潛在效應(yīng)的66�舶被�肽（Nogo��66），并且這個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域也存在于Nogo�睟和Nogo�睠中。Nogo�睞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷時(shí)直接暴露于軸突。另一個(gè)是胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，位于Nogo�睞的胞內(nèi)氨基末端部分，是Nogo�睞所特有的，少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷時(shí)就暴露于Nogo�睞的胞內(nèi)區(qū)域。盡管Nogo�睞在生理和病理的作用尚未明確，但Nogo��66a已被廣泛應(yīng)用。

    MAG是免疫球蛋白超家族中的一種跨膜蛋白質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘中均有分布，它具有黏性，主要由少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，位于軸旁周的膜上，理論上能與軸突相互作用［5］。MAG的一個(gè)突出的特征是神經(jīng)元在一定的狀態(tài)下具有調(diào)節(jié)軸突雙向生長的能力，能促進(jìn)幼小神經(jīng)元的軸突生長［6］。

    OMgp是一種糖基磷脂酰肌醇（GPI)錨定膜蛋白，由少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，最近發(fā)現(xiàn)在體外誘導(dǎo)能引起生長錐塌陷，并抑制軸突生長［7］。OMgp被認(rèn)為是一種重要的髓磷脂抑制分子。

    1.2  膠質(zhì)瘢痕起源的抑制物研究生論文發(fā)表

    脊髓損傷后引起神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)性增生，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分泌多種硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPGs），主要存在于胞外基質(zhì)，包括神經(jīng)蛋白聚糖（neurocan），磷酸肌酸蛋白聚糖（phosphacan），Brevican等，也有其他膠質(zhì)細(xì)胞分泌的多功能蛋白聚糖(versican)，NG2（NG2�瞘lia)等。CSPGs包含核心蛋白和以共價(jià)鍵相連的硫酸軟骨素和氨基側(cè)鏈，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中可調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、遷徙和分化，但在脊髓損傷后，CSPGs 表現(xiàn)出強(qiáng)大的抑制作用，抑制軸突和神經(jīng)細(xì)胞的再生修復(fù)［8］。

    1.3  排斥性軸突導(dǎo)向分子

    RGM是含有GPI附著點(diǎn)的內(nèi)源性抑制蛋白，包括semaphorins（Sema）、ephrins、netrins、slits等［9，10］。這些分子在軸突和樹突的發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，RGM能引起雛雞顳側(cè)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞生長錐塌陷，并能引導(dǎo)顳側(cè)視網(wǎng)膜軸突生長［11，12］。它們?cè)谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)中的持續(xù)表達(dá)預(yù)示著還有其他的作用，已有研究者在海馬中檢測(cè)到semaphorins3和semaphorins4的表達(dá)，提示其在突觸可塑性上有重要作用［13］。在脊髓損傷后，皮質(zhì)脊髓束和紅核脊髓束的軸突表達(dá)semaphorins3的受體，包括neuropilin1、neuropilin2和plexin A ［14］，與semaphorins3A結(jié)合引起背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（dorsal root ganglion neuron,DRGN）軸突抑制［15］。Ephrins是雙功能分子，與細(xì)胞表面的受體Ephs結(jié)合，發(fā)揮軸突導(dǎo)向的作用。其他軸突導(dǎo)向分子netrins和slit可能也有相同的作用，目前還在研究的早期階段。

    2  RhoA

    2.1  RhoA概述

    Rho是一種結(jié)合在胞膜內(nèi)壁上的小GTP酶，分子量為20～30 KD,屬于Ras超家族系中的一類。Rho家族包括RhoA、Rac1和Cdc42等。RhoA具有與GDP結(jié)合的失活態(tài)和與GTP結(jié)合的激活態(tài)，主要受三類蛋白的調(diào)節(jié)：①鳥苷酸交換因子（guanine exchang factor,GEF），它能促進(jìn)GDP/GTP交換反應(yīng)，使GDP�睷hoA轉(zhuǎn)變?yōu)镚TP�睷hoA。②GTP酶活化蛋白（GTPase�瞐ctivating protein,GAP），它主要是通過增加RhoGTPase的內(nèi)在的GTP酶活性，使其轉(zhuǎn)為無活性的GDP結(jié)合狀態(tài)。③GDP解離抑制蛋白（guanine mucleotide dissociation inhibitor,GDI），它能抑制GDP/GTP的交換，從而抑制該家族成員的激活。p75是軸突生長的抑制因子在細(xì)胞膜的受體（Nogo receptor,NgR）的輔助因子，將細(xì)胞外的信息傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)Rho�睪DI與p75結(jié)合時(shí)，RhoA即從Rho�睪DI的抑制中釋放出來，RhoA激活［16，17］。

    2.2  RhoA的作用

    Rho的激活與生長錐的潰變以及生長抑制有關(guān)。RhoA在激活狀態(tài)下，刺激了下游的Rho激酶ROCK，ROCK是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，分為兩型：ROCK�并瘢ㄓ址QRho激酶）和ROCK�并颍琑hoA與ROCK�并窠Y(jié)合，取代了ROCK的C末端自我抑制區(qū)，激活其催化區(qū)，并進(jìn)一步使肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化和MLC磷酸酶磷酸化，抑制了MLC磷酸酶活性，活化MLC，促使應(yīng)力纖維形成，調(diào)節(jié)actin�瞞yosin�并虻氖湛s力，從而影響肌動(dòng)-球蛋白系統(tǒng)而導(dǎo)致生長錐塌陷。ROCK�并褚部勺饔糜贚IM激酶，起到以上作用［18］。

    RhoA通過調(diào)節(jié)生長錐內(nèi)的細(xì)胞骨架的重組來改變神經(jīng)的生長方向。RhoA影響肌球蛋白，而后者在軸突導(dǎo)向中的作用是通過其收縮引起軸突生長錐的回縮及塌陷來實(shí)現(xiàn)的［19，20］。神經(jīng)生長錐內(nèi)的RhoA活性的不對(duì)稱性引起生長錐轉(zhuǎn)向，可能的機(jī)制是當(dāng)生長錐內(nèi)一側(cè)的RhoA活性較另一側(cè)高時(shí)，絲狀偽足在RhoA活性低的一側(cè)受到的抑制較弱，延伸更快，因此生長錐朝向該側(cè)轉(zhuǎn)向［18，20］。

    3  軸突再生抑制分子激活RhoA的機(jī)制

    3.1  髓磷脂抑制分子激活RhoA的機(jī)制

    Fournier等［21］在Nogo發(fā)現(xiàn)一年后就找到了Nogo��66a的受體（NgR）。NgR是GPI錨定膜蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元和軸突中均有表達(dá)［22］。用PI�睵LC(phosphatidy�瞝inositol�瞫pecific phospholipase)處理胚胎背角神經(jīng)元表面的GPI錨定膜蛋白，神經(jīng)元對(duì)Nogo��66的抑制信號(hào)變得不敏感，提示Nogo��66通過GPI錨定膜蛋白NgR介導(dǎo)而發(fā)揮抑制作用。緊接著，另外兩種髓磷脂抑制分子MAG［23］和OMgp［8］也被證實(shí)通過相同的受體NgR介導(dǎo)抑制信號(hào)。NgR缺乏細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，需要一個(gè)跨膜的協(xié)同受體介導(dǎo)信號(hào)傳遞。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子p75突變小鼠對(duì)三種髓磷脂NgR受體缺乏反應(yīng)［24］。Wang等［25］將刪去胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的p75轉(zhuǎn)入生長于含有髓磷脂培養(yǎng)基的小腦顆粒神經(jīng)元中,發(fā)現(xiàn)可引起神經(jīng)元的突起生長，證明p75受體（p75NTR）可作為NgR的一個(gè)協(xié)同受體。

    目前已有證據(jù)顯示RhoA作為一種效應(yīng)器介導(dǎo)髓磷脂抑制分子引起的抑制信號(hào)，在培養(yǎng)的小腦顆粒神經(jīng)元中被MAG�睩c激活［24］，NgR復(fù)合物與MAG, Nogo和OMgp結(jié)合引起下游信號(hào)并導(dǎo)致RhoA和它的效應(yīng)器ROCK的激活。p75NTR能使RhoA從Rho�睪DI中釋放出來，當(dāng)p75NTR激活后，RhoA被釋放出來，并被另一個(gè)因子Rho�睪EF所激活，使RhoA從與GDP結(jié)合的失活形式轉(zhuǎn)變成與GTP結(jié)合的激活態(tài)。抑制p75與Rho�睪DI之間相互作用的短肽能減弱髓磷脂抑制軸突再生的作用，說明p75與Rho�睪DI之間的這種作用可能與髓磷脂抑制作用有關(guān)。

    3.2  硫酸軟骨素蛋白多糖激活RhoA的機(jī)制

    已有報(bào)告證實(shí)CSPGs能抑制軸突再生［26］，但 CSPGs的受體及作用機(jī)制還不清楚。NgR不是CSPGs產(chǎn)生效應(yīng)所必需的受體，髓磷脂抑制分子的p75NTR復(fù)合受體也不是必需的，在缺失p75NTR復(fù)合受體的動(dòng)物神經(jīng)元中軸突再生仍受CSPGs抑制，而不受髓磷脂抑制分子抑制［27］。近年來研究認(rèn)為，RhoA通路與CSPGs的抑制有關(guān)。雞胚的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元神經(jīng)蛋白聚糖底物可以刺激GTPase家族的RhoA通路，增加RhoA�睪TP的含量，通過特殊的阻滯劑Y��27632阻滯Rho激酶ROCK后，可以減輕神經(jīng)蛋白聚糖的抑制作用［28］。多功能蛋白聚糖（來自成纖維細(xì)胞的一種蛋白聚糖）在小腦顆粒神經(jīng)元（cerebellar granule neurons,CGNS）中也能增加RhoA�睪TP的含量，并減少Rac1�睪TP的數(shù)量［27］。這些都能使RhoA活性增高，從而抑制軸突生長，可以推測(cè)CSPGs在一定程度上激活了RhoA。研究生論文發(fā)表

    3.3  RGM激活RhoA的機(jī)制

    在軸突導(dǎo)向分子傳遞信號(hào)給細(xì)胞骨架的過程中，RhoA發(fā)揮了一定的作用。不同的軸突導(dǎo)向分子通過各自獨(dú)特的受體傳遞信號(hào)，semaphorins 3 的受體是neuropilin 1和/或neuropilin 2,由于它缺乏細(xì)胞內(nèi)信號(hào)結(jié)合區(qū)域，需與plexin A 成為復(fù)合受體，而Sema4D直接與plexin B結(jié)合。不管是semaphorins 還是ephrins引起信號(hào)傳遞導(dǎo)致生長錐細(xì)胞骨架的變化都是通過RhoGTPase介導(dǎo)的。依賴于RhoA激活的Sema4D的活性，受到RhoGEFs激活的介導(dǎo)，在海馬神經(jīng)元及其他細(xì)胞中用Rho激酶阻滯劑Y27632能夠阻滯Sema4D介導(dǎo)的生長錐塌陷［29］。可見semaphorins在脊髓損傷后抑制軸突的再生，通過阻滯semaphorins可以抑制RhoA的活性，從而促進(jìn)軸突再生。

 4  結(jié)  語

    軸突再生抑制分子是脊髓損傷后軸突再生的主要原因，近年來對(duì)其抑制功能的研究很多，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RhoA信號(hào)通路參與了抑制軸突再生的機(jī)制。通過干預(yù)該信號(hào)通路，能夠抑制Rho的活性，已經(jīng)在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)失活的Rho能促進(jìn)脊髓損傷后的小鼠軸突再生及功能恢復(fù)［30］，這為今后脊髓損傷的治療提供了新的方向。

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