RNAi沉默PRL1基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞侵襲能力的影響

【摘要】  　　目的： 探討RNA干擾(RNA interference，RNAi)沉默促肝細(xì)胞再生磷酸酶 1(phosphatase of regenerating liver cell��1，PRL��1)基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞侵襲力的影響。方法： 應(yīng)用PRL��1 基因小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染處理肺癌A549細(xì)胞后，分別采用實(shí)時(shí)定量RT�睵CR和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)PRL��1基因mRNA和蛋白水平，分別采用軟瓊脂集落培養(yǎng)試驗(yàn)和Boyden小室模型試驗(yàn)檢測(cè)癌細(xì)胞的錨著不依賴性增殖和侵襲能力。結(jié)果： 與對(duì)照組比較，siRNA轉(zhuǎn)染組PRL��1 mRNA和蛋白水平明顯下調(diào)，且呈濃度和時(shí)間依賴性（P<0.05，P<0.05）。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PRL��1 siRNA可有效抑制肺癌細(xì)胞集落生長和侵襲能力，且與濃度相關(guān)（P<0.05，P<0.05）。結(jié)論： PRL��1基因在肺癌侵襲中起著重要的作用，采用PRL��1 siRNA轉(zhuǎn)染可抑制肺癌細(xì)胞侵襲。

【關(guān)鍵詞】  肺腫瘤； 促肝細(xì)胞再生磷酸酶��1； 侵襲； RNA干擾； 小干擾RNA

　�。跘bstract］Objective: To study the effects and mechanism of phosphatase of regenerating liver cell��1（PRL��1）small interfering RNA（siRNA）on invasion of human lung cancer cell.Methods： After lung cancer cell line A549 were transfected by PRL��1 siRNA, the mRNA and protein of PRL��1 were determined by real time RT�睵CR and western blot assay,respectively.The anchorage�瞚ndependent growth was exmined by clon formation in soft agar,and invasion ability was eva luated by boyden chamber model. Results： The siRNA could down�瞨egulate the level of mRNA and protein of PRL��1 in a dose�� and time�� dependent manner. Suppression of of PRL��1 expression can inhibit invasion ability and anchorage�瞚ndependent growth in dose�瞕ependent manners（P<0.05, P<0.05）.  Conclusion： PRL��1 gene might play an important role in development of human lung cancer, and down�瞨egulation by PRL��1 siRNA could inhibit invasion of human lung cancer cell.

　�。跭ey words］lung carcinoma； phosphatase of regenerating liver cell��1； invasion；RNA interference； small interfering RNA

    蛋白酪氨酸磷酸酶(proteintyrosinephosphatase,PTP)在蛋白磷酸化和去磷酸化平衡中起著重要的作用。促肝再生磷酸酶(phosphatase of regenerating liver,PRLs)是PTP酶家族重要成員之一，該基因家族包括PRL��1，PRL��2，PRL��3 三個(gè)成員,它們分別定位在6q12,1p35,8q24.3染色體上,彼此之間的同源性高達(dá)76%～85%［1，2］。
   
　　許多實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PRLs分子能導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化并且增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖、移動(dòng)、浸潤和轉(zhuǎn)移能力［3-10］。但目前對(duì)PRL��1基因在肺癌細(xì)胞侵襲中的研究甚少。本研究借助于RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)，以合成的PRL��1基因小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染處理肺癌A549細(xì)胞，觀察了PRL��1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)癌細(xì)胞侵襲力的影響。護(hù)理論文發(fā)表

    1  材料與方法

　　1.1  材料
       
　　人肺癌A549細(xì)胞，購自上海生命科學(xué)院。PRL��1 siRNA序列（5′�睪AUGCAGUUCAGUUUAUAATT��3′和5′�睻UAUAAACUGAACUGCAUCTT��3′），由美國Dharmacon公司合成。PRL��1抗體購自Santa Cruz公司。Trizol，RNase抑制劑，逆轉(zhuǎn)錄酶SSRTⅡ，Taq酶和轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine購自美國Invitrogen公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染處理
       
　　肺癌A549細(xì)胞在含10％胎牛血清的RBMI 1640培養(yǎng)液、37℃、5％CO2、飽和濕度環(huán)境的條件下連續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天，將1.0×105對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，1 ml/孔，培養(yǎng)過夜。次日進(jìn)行轉(zhuǎn)染�；�本操作按說明書進(jìn)行。細(xì)胞分組：（1）空白對(duì)照組（Con�睞）：未經(jīng)任何處理的肺癌細(xì)胞；（2）空載對(duì)照組（Con�睟）：即脂質(zhì)體對(duì)照組；（3）錯(cuò)配對(duì)照組（Con�睠）；（4）siRNA組：10％胎牛血清的RBMI 1640中含不同濃度（3.125，6.25，12.5 nmol/L）的已用脂質(zhì)體包埋的siRNA。轉(zhuǎn)染后于不同時(shí)間采用胰酶消化收取細(xì)胞，進(jìn)行以下試驗(yàn)。

　　1.2.2  肺癌細(xì)胞PRL��1基因檢測(cè)

　　1.2.2.1  mRNA水平

　　采用熒光實(shí)時(shí)定量RT�睵CR檢測(cè)。收集細(xì)胞，以Trizol抽提細(xì)胞總RNA, 取總RNA 1  μg，以O(shè)ligo dT（15 mer）為引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以此cDNA鏈2 μl為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，步驟參照說明書進(jìn)行。PRL��1定量PCR引物：上游5′�睞TGGCTCGAATGAACCGCCCAG��3′；下游5′�睺TATTGAATGCAACAGTTGTTT��3′。以3�擦姿岣视腿┟摎涿富�因(GAPDH)為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件為：95℃，預(yù)變性3 min，95℃，30 s；52℃，45 s；72℃，45 s。35 個(gè)循環(huán)后，72℃再延伸7 min。

　　1.2.2.2  蛋白水平

　　采用蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)。提取對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后進(jìn)行常規(guī)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。利用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software （Eastman Kodak Company，USA)測(cè)定蛋白質(zhì)印跡條帶凈灰度值，并與內(nèi)參照β �布�動(dòng)蛋白的測(cè)定結(jié)果相比較，計(jì)算其比值。

　　1.2.3  軟瓊脂集落形成試驗(yàn)

　　參照文獻(xiàn)［11］方法，進(jìn)行軟瓊脂集落培養(yǎng)試驗(yàn)，觀測(cè)PRL��1 siRNA對(duì)肺癌細(xì)胞錨著不依賴性增殖的影響。

　　1.2.4  體外侵襲試驗(yàn)

　　參照文獻(xiàn)［12］方法，在Boyden小室模型中進(jìn)行觀察。400倍光鏡下計(jì)數(shù)穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)，以侵襲細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞侵襲能力。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，每組計(jì)數(shù)3份樣本。

　　1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
      
　　數(shù)據(jù)資料以±s表示，用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P<0.01為差異有顯著性。

　　2  結(jié)果

　　2.1  siRNA敲除對(duì)肺癌細(xì)胞PRL��1基因的影響

    經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)PRL��1基因mRNA和蛋白水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞比較，siRNA組PRL��1 mRNA和蛋白水平明顯降低（P<0.05，P<0.05）(圖1，圖2）。

　　2.2  PLR��1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)癌細(xì)胞軟瓊脂集落形成的影響

    軟瓊脂集落形成試驗(yàn)結(jié)果顯示，肺癌A549細(xì)胞在體外半固體培養(yǎng)體系中可以自發(fā)地形成集落，而經(jīng)PRL��1 siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞集落生長呈劑量依賴性減少(P<0.05）。
　2.3  PRL��1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲的影響
    Boyden小室上室細(xì)胞穿過膜上matrigel到膜的下室面，其數(shù)量反映了細(xì)胞侵襲能力的大小。收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，采用Boyden小室模型檢測(cè)癌細(xì)胞侵襲情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，siRNA組穿過濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯下降，且與濃度相關(guān)(P<0.05）。護(hù)理論文發(fā)表
   
　　3  討 論

    RNAi是近年來發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)mRNA的生物學(xué)現(xiàn)象，能使基因的mRNA被相應(yīng)的雙鏈RNA分子剔除，其效果要遠(yuǎn)強(qiáng)于正義和反義RNA［13］。RNAi最主要的功能在于可以調(diào)節(jié)和關(guān)閉基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種高級(jí)生命活動(dòng)。而siRNA是指RNAi過程中在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的長約21～25核苷酸(nt)的小雙鏈RNA分子，是RNAi作用機(jī)制的重要中間效應(yīng)分子。而且已有人工化學(xué)合成的siRNA，具有明顯的剔除相應(yīng)基因mRNA的效果［10,13-16］。由于siRNA具有高效剔除基因表達(dá)的工具，已被廣大科學(xué)工作者用作研究基因功能和基因治療的工具。

    在PRLs家族中，PRL��1是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的基因，它是在鼠的3T3成纖維細(xì)胞中作為肝再生早期反應(yīng)的基因被發(fā)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了PRL��1的小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)［3］，提示PRL��1基因可促進(jìn)某些癌細(xì)胞增殖。但PRL��1在肺癌細(xì)胞中作用尚不清楚。

    為了解PRL��1基因在肺癌細(xì)胞侵襲中的作用，本研究根據(jù)PRL��1基因mRNA特點(diǎn)，設(shè)計(jì)siRNA序列，并用化學(xué)方法合成siRNA，轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞后，分別采用熒光實(shí)時(shí)定量RT�睵CR和蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)PRL��1基因mRNA和蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞PRL��1基因mRNA和蛋白水平明顯下降，提示PRL��1 siRNA轉(zhuǎn)染成功。
  
　　接著，我們從體外觀察了PRL��1基因 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲的影響。
   
　　正常真核細(xì)胞，除成熟血細(xì)胞外，大多需黏附于特定的細(xì)胞外基質(zhì)上才能抑制凋亡而存活，稱為錨著依賴性（anchorage dependence）。腫瘤細(xì)胞可以錨著不依賴性狀態(tài)生長。腫瘤細(xì)胞在軟瓊脂形成集落的多少與惡性程度呈正相關(guān)。軟瓊脂集落培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)PRL��1 siRNA轉(zhuǎn)染處理的肺癌細(xì)胞軟瓊脂集落數(shù)和穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，且呈濃度依賴性。

    Boyden小室模型或Transwell是檢測(cè)癌細(xì)胞侵襲試驗(yàn)的經(jīng)典模型，已被廣泛應(yīng)用于探討癌細(xì)胞侵襲的相關(guān)研究中。本研究將經(jīng)PRL��1 siRNA轉(zhuǎn)染處理的肺癌549細(xì)胞置于Boyden小室模型中，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組肺癌細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，且呈濃度依賴性，提示PRL��1下調(diào)可抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力。

    本研究提示，PRL��1基因在肺癌細(xì)胞侵襲中起著重要的作用，以siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)可明顯抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力，其內(nèi)在機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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