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RNAi沉默PRL1基因對肺癌細胞侵襲能力的影響

作者:時間:2011-03-25 14:01:00 來源:www.6scc.cn 閱讀次數:1147次 ]

【摘要】　　目的：探討RNA干擾(RNA interference，RNAi)沉默促肝細胞再生磷酸酶 1(phosphatase of regenerating liver cell1，PRL1)基因對肺癌細胞侵襲力的影響。方法：應用PRL1 基因小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉染處理肺癌A549細胞后，分別采用實時定量RTPCR和蛋白質印跡檢測PRL1基因mRNA和蛋白水平，分別采用軟瓊脂集落培養試驗和Boyden小室模型試驗檢測癌細胞的錨著不依賴性增殖和侵襲能力。結果：與對照組比較，siRNA轉染組PRL1 mRNA和蛋白水平明顯下調，且呈濃度和時間依賴性（P<0.05，P<0.05）。體外試驗發現，PRL1 siRNA可有效抑制肺癌細胞集落生長和侵襲能力，且與濃度相關（P<0.05，P<0.05）。結論： PRL1基因在肺癌侵襲中起著重要的作用，采用PRL1 siRNA轉染可抑制肺癌細胞侵襲。

【關鍵詞】肺腫瘤；促肝細胞再生磷酸酶1；侵襲； RNA干擾；小干擾RNA

　　［Abstract］Objective: To study the effects and mechanism of phosphatase of regenerating liver cell1（PRL1）small interfering RNA（siRNA）on invasion of human lung cancer cell.Methods： After lung cancer cell line A549 were transfected by PRL1 siRNA, the mRNA and protein of PRL1 were determined by real time RTPCR and western blot assay,respectively.The anchorageindependent growth was exmined by clon formation in soft agar,and invasion ability was eva luated by boyden chamber model. Results： The siRNA could downregulate the level of mRNA and protein of PRL1 in a dose and time dependent manner. Suppression of of PRL1 expression can inhibit invasion ability and anchorageindependent growth in dosedependent manners（P<0.05, P<0.05）. Conclusion： PRL1 gene might play an important role in development of human lung cancer, and downregulation by PRL1 siRNA could inhibit invasion of human lung cancer cell.

　　［Key words］lung carcinoma； phosphatase of regenerating liver cell1； invasion；RNA interference； small interfering RNA

蛋白酪氨酸磷酸酶(proteintyrosinephosphatase,PTP)在蛋白磷酸化和去磷酸化平衡中起著重要的作用。促肝再生磷酸酶(phosphatase of regenerating liver,PRLs)是PTP酶家族重要成員之一，該基因家族包括PRL1，PRL2，PRL3 三個成員,它們分別定位在6q12,1p35,8q24.3染色體上,彼此之間的同源性高達76%～85%［1，2］。

　　許多實驗研究發現，PRLs分子能導致細胞的惡性轉化并且增強腫瘤細胞的增殖、移動、浸潤和轉移能力［3-10］。但目前對PRL1基因在肺癌細胞侵襲中的研究甚少。本研究借助于RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術，以合成的PRL1基因小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉染處理肺癌A549細胞，觀察了PRL1 siRNA轉染對癌細胞侵襲力的影響。護理論文發表

1 材料與方法

　　1.1 材料

　　人肺癌A549細胞，購自上海生命科學院。PRL1 siRNA序列（5′GAUGCAGUUCAGUUUAUAATT3′和5′UUAUAAACUGAACUGCAUCTT3′），由美國Dharmacon公司合成。PRL1抗體購自Santa Cruz公司。Trizol，RNase抑制劑，逆轉錄酶SSRTⅡ，Taq酶和轉染試劑Oligofectamine購自美國Invitrogen公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 細胞培養及轉染處理

　　肺癌A549細胞在含10％胎牛血清的RBMI 1640培養液、37℃、5％CO2、飽和濕度環境的條件下連續培養。轉染前1天，將1.0×105對數期生長的細胞接種于24孔培養板，1 ml/孔，培養過夜。次日進行轉染。基本操作按說明書進行。細胞分組：（1）空白對照組（ConA）：未經任何處理的肺癌細胞；（2）空載對照組（ConB）：即脂質體對照組；（3）錯配對照組（ConC）；（4）siRNA組：10％胎牛血清的RBMI 1640中含不同濃度（3.125，6.25，12.5 nmol/L）的已用脂質體包埋的siRNA。轉染后于不同時間采用胰酶消化收取細胞，進行以下試驗。

　　1.2.2 肺癌細胞PRL1基因檢測

　　1.2.2.1 mRNA水平

　　采用熒光實時定量RTPCR檢測。收集細胞，以Trizol抽提細胞總RNA, 取總RNA 1 μg，以Oligo dT（15 mer）為引物逆轉錄合成cDNA第一鏈，以此cDNA鏈2 μl為模板進行PCR擴增，步驟參照說明書進行。PRL1定量PCR引物：上游5′ATGGCTCGAATGAACCGCCCAG3′；下游5′TTATTGAATGCAACAGTTGTTT3′。以3磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)為內參。PCR反應條件為：95℃，預變性3 min，95℃，30 s；52℃，45 s；72℃，45 s。35 個循環后，72℃再延伸7 min。

　　1.2.2.2 蛋白水平

　　采用蛋白質印跡方法檢測。提取對照組和各實驗組細胞總蛋白，蛋白定量后進行常規蛋白質印跡檢測。利用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software （Eastman Kodak Company，USA)測定蛋白質印跡條帶凈灰度值，并與內參照β 肌動蛋白的測定結果相比較，計算其比值。

　　1.2.3 軟瓊脂集落形成試驗

　　參照文獻［11］方法，進行軟瓊脂集落培養試驗，觀測PRL1 siRNA對肺癌細胞錨著不依賴性增殖的影響。

　　1.2.4 體外侵襲試驗

　　參照文獻［12］方法，在Boyden小室模型中進行觀察。400倍光鏡下計數穿過聚碳酸酯膜的細胞數，以侵襲細胞的相對數目表示腫瘤細胞侵襲能力。隨機計數5個視野內的細胞數，取平均值進行統計處理，每組計數3份樣本。

　　1.3 統計學方法

　　數據資料以±s表示，用SPSS 10.0統計學軟件進行處理。組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義，以P<0.01為差異有顯著性。

　　2 結果

　　2.1 siRNA敲除對肺癌細胞PRL1基因的影響

經實時定量PCR和蛋白質印跡檢測PRL1基因mRNA和蛋白水平，結果顯示，與對照組細胞比較，siRNA組PRL1 mRNA和蛋白水平明顯降低（P<0.05，P<0.05）(圖1，圖2）。

　　2.2 PLR1 siRNA轉染對癌細胞軟瓊脂集落形成的影響

    軟瓊脂集落形成試驗結果顯示，肺癌A549細胞在體外半固體培養體系中可以自發地形成集落，而經PRL1 siRNA轉染的細胞集落生長呈劑量依賴性減少(P<0.05）。
　2.3 PRL1 siRNA轉染對肺癌細胞侵襲的影響
    Boyden小室上室細胞穿過膜上matrigel到膜的下室面，其數量反映了細胞侵襲能力的大小。收集轉染48 h的細胞，采用Boyden小室模型檢測癌細胞侵襲情況。結果發現，與對照組比較，siRNA組穿過濾膜的細胞數明顯下降，且與濃度相關(P<0.05）。護理論文發表

　　3 討論

RNAi是近年來發現的一種調節mRNA的生物學現象，能使基因的mRNA被相應的雙鏈RNA分子剔除，其效果要遠強于正義和反義RNA［13］。RNAi最主要的功能在于可以調節和關閉基因的表達，進而調控細胞的各種高級生命活動。而siRNA是指RNAi過程中在細胞內產生的長約21～25核苷酸(nt)的小雙鏈RNA分子，是RNAi作用機制的重要中間效應分子。而且已有人工化學合成的siRNA，具有明顯的剔除相應基因mRNA的效果［10,13-16］。由于siRNA具有高效剔除基因表達的工具，已被廣大科學工作者用作研究基因功能和基因治療的工具。

在PRLs家族中，PRL1是第1個被發現的基因，它是在鼠的3T3成纖維細胞中作為肝再生早期反應的基因被發現的。研究發現，轉染了PRL1的小鼠成纖維細胞系NIH3T3細胞增殖明顯增強［3］，提示PRL1基因可促進某些癌細胞增殖。但PRL1在肺癌細胞中作用尚不清楚。

    為了解PRL1基因在肺癌細胞侵襲中的作用，本研究根據PRL1基因mRNA特點，設計siRNA序列，并用化學方法合成siRNA，轉染肺癌A549細胞后，分別采用熒光實時定量RTPCR和蛋白質印跡方法檢測PRL1基因mRNA和蛋白水平，結果發現，轉染組細胞PRL1基因mRNA和蛋白水平明顯下降，提示PRL1 siRNA轉染成功。

　　接著，我們從體外觀察了PRL1基因 siRNA轉染對肺癌A549細胞侵襲的影響。

　　正常真核細胞，除成熟血細胞外，大多需黏附于特定的細胞外基質上才能抑制凋亡而存活，稱為錨著依賴性（anchorage dependence）。腫瘤細胞可以錨著不依賴性狀態生長。腫瘤細胞在軟瓊脂形成集落的多少與惡性程度呈正相關。軟瓊脂集落培養試驗結果顯示，經PRL1 siRNA轉染處理的肺癌細胞軟瓊脂集落數和穿膜細胞數明顯減少，且呈濃度依賴性。

Boyden小室模型或Transwell是檢測癌細胞侵襲試驗的經典模型，已被廣泛應用于探討癌細胞侵襲的相關研究中。本研究將經PRL1 siRNA轉染處理的肺癌549細胞置于Boyden小室模型中，結果顯示，轉染組肺癌細胞穿膜細胞數明顯減少，且呈濃度依賴性，提示PRL1下調可抑制肺癌細胞的侵襲能力。

本研究提示，PRL1基因在肺癌細胞侵襲中起著重要的作用，以siRNA轉染下調可明顯抑制肺癌細胞的侵襲能力，其內在機制尚需進一步深入研究。

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