β3GalT7基因轉染HL��60細胞及對其生物學行為的影響

【摘要】  　　目的： 初步探討人類β1，3半乳糖基轉移酶7（β3GalT7）基因對HL60細胞的細胞周期、侵襲能力等方面的影響。方法： 通過脂質體介導將本實驗室構建好的β3GalT7真核正義表達載體pEGFP�睠1�睺7�睸ense和反義表達載體pEGFP�睠1�睺7�睞ntiSense轉染入HL60細胞；流式細胞儀分析各細胞株的細胞周期改變；Transwell侵襲實驗檢測β3GalT7對HL60細胞侵襲轉移能力的影響。結果： 隨著β3GalT7 表達的增高，G2+S期細胞增多，且細胞侵襲能力增強；而轉染反義表達載體pEGFP�睠1�睺7�睞ntiSense的結果是相反的。結論： 過度表達β3GalT7的HL��60細胞株體外增殖和侵襲能力增強。

【關鍵詞】  β1，3半乳糖基轉移酶7； 正義表達載體； 反義表達載體； 細胞周期； 侵襲

　　［Abstract］Objective: To explore the effects of β3GalT7 gene on cell cycle, invasive potential of HL��60.Methods： Transfect the recombinant plasmids pEGFP�睠1�睺7�睸ense and pEGFP�睠1�睺7�睞ntiSense into HL��60 with  liposomes.Cell cycle and  invasive potential of the transfected cells with flow cytometry and transwell plate,respectively. Results： As the up�瞨egulation expression of β3GalT7, the cell growth rate increased. At 48 h after transfection, significantly increased invasiveness was noted in HL60 transfected with pEGFP�睠1�睺7�睸ense.  Conclusion： Over�瞖xpressing β3GalT7 in HL��60 enhanced proliferative and invasive potential.

　　［Key words］beta 1, 3�瞘alactosyltransferase 7；plus sense recombinant plasmid； antisense recombinant plasmid；cell cycle；invasive potential

    β1,3�舶肴樘腔�轉移酶家族是糖基轉移酶超家族中最具代表性的酶家族之一，β1,3�舶肴樘腔�轉移酶7(beta1,3�瞘alactosyltransferase 7,β3GalT7)基因是我們實驗室從人肺cDNA文庫中克隆到的人類β3�舶肴樘腔�轉移酶家族中的一個新成員［1,2］。
   
　　在此之前，β1,3�舶肴樘腔�轉移酶家族已經克隆到6個成員(β3Gal�睺1,T2,T3,T4,T5,T6)［3］。他們都以UDP�拨联睤�舶肴樘牵║DP�拨联睪al）為供體基團，與之結合，把半乳糖（Gal）轉移給受體底物，如各種不同的糖蛋白，糖胺聚糖，糖脂或激素等脂質小分子。研究顯示，這些家族的許多成員可能與腫瘤的發生發展和浸潤轉移有關。在多種腫瘤細胞株中，β3GalT7都有不同程度的表達，而β3GalT7基因在急性粒細胞白血病細胞株HL60細胞中有中度表達。
   
　　為進一步闡明β3GalT7與腫瘤增殖和浸潤轉移的相關性，尤其是在惡性血液病中的作用，我們以HL60細胞株作為研究對象，分別特異性地上調及抑制β3GalT7基因在HL60細胞的表達，從而對其功能進行初步的研究。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  細胞來源

　　急性粒細胞白血病細胞株HL60購自上海生化細胞所。

　　1.1.2  主要試劑

　　小牛血清購自南京大治生物公司；1640完全培養基：每升RPMI1640基礎培養基（Gibco,美國）中，添加小牛血清100 ml、L�补劝滨０�0.15 g，NaHCO3 2.0 g、葡萄糖3.6 g、HEPES(Amresco進口分裝)4.7 g；胰蛋白酶購自Sigma公司；DEPC購自上海華舜生物工程公司；六堿基隨機引物購自Invitrogen公司；Trizol，RNase Inhibitor，Superscript Ⅱ RNase H Reverse transcriptase購自Invitrogen公司；Taq DNA酶，dNTP MIX（10 mmol/L），10×PCR緩沖液，MgCl2(25 mmol/L)購自Promega公司；DNA 標準參照物購自南京大治公司;瓊脂糖購自華美公司（Promega進口分裝）。職稱論文怎么發表

　　1.2  方法

　　1.2.1  細胞轉染

　　通過lipofectamine 2 000脂質體介導的方法將正義重組載體pEGFP�睠1�睺7�睸ense 和反義重組載體pEGFP�睠1�睺7�睞ntiSense及空表達載體pEGFP�睠1分別轉染急性粒細胞白血病HL��60細胞，分別命名為HL60�睸,HL60�睞S及HL60��0。48 h后收集細胞，在熒光顯微鏡下觀察轉染后細胞。

　　1.2.2  β3GalT7 mRNA表達的RT�睵CR檢測

　　分別收集處于生長對數期的細胞按 Trizol Reagent(Invitrogen公司) 操作手冊提取總 RNA, 1%甲醛變性瓊脂糖電泳檢測 RNA完整性。取總 RNA 2 μg反轉錄為 cDNA第1鏈,再進行 PCR擴增。擴增產物以 2%的瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙啶染色,圖像分析儀攝像并分析結果。設計引物采用Genetyx軟件,并經基因庫Blast進行同源檢索后合成。引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列為：正義鏈 5′�睠TATGTGCCCGAGTCCTTCTTCG��3′(1324��1346 nt），反義鏈5′�睪CAGTTGTTTCCAGAGCCGAATG��3′(1603��1625 nt)，預期擴增產物長度302 bp。PCR反應體系50 μl,反應條件: 95℃預變性 3 min, 95℃ 30 s, 56℃ 45 s, 72℃ 1 min,35個循環,72℃延長 10 min。

　　1.2.3  蛋白質印跡檢測β3GalT7在蛋白水平的表達

　　用蛋白質印跡方法(按分子克隆操作)，檢測轉染細胞中β3GalT7表達的變化。

　　1.2.4  流式細胞術檢測細胞周期的變化

　　待測樣本制成單細胞懸液，然后2 000 g離心5 min，棄上清。用4℃預冷的70%乙醇固定，4℃保存，固定18 h以上。調整細胞濃度為106細胞/ml，取1 ml細胞懸液，用PBS洗3次，細胞重懸于1 ml碘化丙啶(propyldium iodide,PI)染液中，37℃孵育30 min即可進行流式分析G1期和G2，S期比例。PI染液終濃度為50 μg/ml，RNase終濃度為20 μg /ml。

　　1.2.5  轉染細胞的體外穿膜實驗

　　采用Transwell Polycarbonate Membrane模擬體外細胞侵襲模型。上下室之間置8 μm 微孔濾膜,將Matrigel稀釋成5 mg/L，膜上鋪50 μl稀釋的Matrigel;下室加入含有5 mg/L纖維連接蛋白的無血清培養基，上室加預處理的轉染48 h和對照組HL60細胞懸液,調節濃度為1×105/室，各取 200 μl。37 ℃,5% CO2飽和濕度下培養24 h,取出insert槽，將下層溶液混勻，對其中的細胞進行計數，得出穿膜細胞占總細胞數的百分比，代表細胞侵襲力。
1.2.6  統計學處理

　　采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料數據用均值±標準差(±s)表示，兩組間均數比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

　　2  結果

　　2.1  熒光成像系統觀察轉染后細胞
    
　　將細胞置于熒光顯微鏡下，可以看到轉染后的HL60細胞在激發波長為507 nm時發出綠色熒光(圖1)。

　　2.2  RT�睵CR檢測β3GalT7 mRNA的表達

    轉染pEGFP�睠1�睺7�睸ense載體的HL60�睸組細胞的β3GalT7 mRNA表達量相對于空白對照的HL60細胞株有了明顯提高，而HL60�睞S組細胞株相對于空白對照的HL60細胞株其β3GalT7 mRNA表達量得到了抑制，轉染pEGFP�睠1空載體的HL60��0組細胞的β3GalT7 mRNA表達量相對于空白對照沒有明顯變化（圖2)。

　　2.3  蛋白質印跡檢測轉染細胞β3GalT7蛋白表達量

    將4組細胞HL60,HL60��0,HL60�睸,HL60�睞S提取蛋白進行蛋白質印跡檢測β3GalT7的表達情況。發現轉染了pEGFP�睠1�睺7�睸ense載體的HL60�睸細胞其β3GalT7的蛋白表達量有所增加，而轉染了pEGFP�睠1�睺7�睞ntiSense載體的HL60�睞S細胞其β3GalT7的蛋白表達則受到了抑制，轉染了空載體的HL60��0 細胞β3GalT7蛋白表達無明顯變化(圖3)。

　　2.4  流式細胞術檢測細胞周期的改變

    收集轉染后48 h的細胞進行細胞周期分析，結果顯示：轉染β3GalT7上調表達HL60細胞G2期和S期比例（70.1±3.24）%高于對照組（65.2±2.38）%（P<0.05），轉染β3GalT7下調表達的HL60細胞G2期和S期比例（55.8±3.82）%低于對照組（P<0.05），轉染空表達載體的G2期和S期比例（66.7±2.52）%和對照組比較差異無統計學意義。

    2.5  轉染細胞的體外穿膜實驗結果

    轉染后48 h，Transwell板檢測發現pEGFP�睠1�睺7�睸ense組下槽細胞占細胞總數的(11.82±1.18)%，pEGFP�睠1�睺7�睞ntiSense組下槽細胞占細胞總數的（3.24±0.89）%，pEGFP�睠1載體組下槽細胞占細胞總數的(8.05±1.45)%。對照組下槽細胞占細胞總數的(6.92 ±1.21)%。pEGFP�睠1�睺7�睸ense組細胞侵襲能力明顯高于對照組（P<0.05），而pEGFP�睠1�睺7�睞ntiSense組細胞侵襲能力明顯低于對照組（P<0.05），pEGFP�睠1組細胞侵襲能力和對照組比較差異無統計學意義(圖4）。職稱論文怎么發表
   
　　3  討論
    
　　細胞癌變過程中常伴有糖鏈結構改變, 目前認為腫瘤細胞糖蛋白糖鏈結構異常是惡性轉化和腫瘤轉移的普遍特征，如糖鏈分支末端出現重復N�惨阴０被�半乳糖結構、唾液酸和巖藻糖含量增加等,這些變化在臨床上常用作腫瘤標記物。糖鏈結構改變可反映在細胞表面糖復合物上,也可反映在分泌的糖復合物中,而主要是在細胞表面糖復合物上。因此,細胞表面的改變必然對癌細胞之間及癌細胞與細胞外基質之間的相互作用產生影響,對癌細胞的行為如癌瘤增大、侵襲與轉移等也產生重要影響。腫瘤細胞表面的糖蛋白糖鏈結構異常的基礎是糖基轉移酶的變化，因此有人認為，糖基轉移酶就是通過影響糖鏈的改變,而間接關系到癌瘤的發展。Ishida等［4］曾報道β3GalT7（β3Gn�睺8）在結腸癌中顯著上調，與結腸癌關系密切。
   
　　過去有研究對來自各類白血病患者的細胞以及白血病細胞株中糖基轉移酶活性進行檢測，結果顯示，除了慢性淋巴性白血病中巖藻糖基轉移酶活性較正常低外，其他被測酶的活性都是白血病細胞較正常細胞高，而且各種酶之間表達分布也有明顯差異。本室之前的研究表明，β3GalT7基因在HL60細胞中呈中度表達，在本研究中，我們通過將本室構建好的β3GalT7正義與反義表達載體轉染人HL60細胞，來上調及抑制β3GalT7基因在HL60細胞的表達，初步研究β3GalT7基因的生物學功能。

    在腫瘤細胞表面類似黏蛋白的糖蛋白中有豐富的O�蔡腔�化結構域，在腫瘤的轉移和浸潤生長過程中黏蛋白起著重要的作用，O�蔡腔�化可能與腫瘤的發生發展密切相關［5］。在O�蔡腔�化過程中，β1,3�舶肴樘腔�轉移酶家族發揮重要功能。我們的研究發現，細胞轉染了pEGFP�睠1�睺7�睸ense后G1期細胞減少，G2期和S期細胞增多，細胞增殖速度加快；而轉染了pEGFP�睠1�睺7�睞ntiSense載體后G2期和S期細胞減少。大多數聚糖位于細胞和分泌的大分子的外周表面，他們處在調控和介導多種細胞-細胞和細胞-基質相互作用的位置。由于糖基轉移酶的表達異常可能會引起糖鏈結構的改變和糖基化位點出現異常，而蛋白質糖基化的改變與許多細胞生物學效應密切相關。在腫瘤細胞浸潤和轉移過程中基質金屬蛋白酶的表達受多水平嚴格調控，β3GalT7作為糖基轉移酶，其表達的上調或抑制影響了細胞表面的糖蛋白糖鏈結構，從而影響受體配體結合，細胞通路及信號轉導等生物學行為，因而或許帶來表達調控基因的改變。另一方面也有可能因為β3GalT7表達的異常增高，帶來糖鏈異常，有利于癌細胞之間或癌細胞與基質之間作用，促使腫瘤浸潤轉移，導致腫瘤轉移相關因子表達增加，而這些因子高表達反過來又促進腫瘤增殖侵襲轉移，形成惡性循環。我們推測β3GalT7表達上調可能在腫瘤細胞的侵襲中起到促進作用，這和Transwell體外穿膜的結果是一致的。鑒于以上結果我們推測β3GalT7與腫瘤的增殖和浸潤轉移是密切相關的，但其具體機制有待進一步探討。

【參考文獻】
  　　［1］Huang C, Zhou J, Wu S，et al.Cloning and tissue distributrion of a the human β3GalT7 gene, a member of the β1,3�睪lycosyltransferase family［J］.Glycoconj J，2004，21(5): 267-273.

　　［2］周嘉梁, 黃超群, 吳士良，等.人類新型β3半乳糖基轉移酶基因β3GalT7的克隆和鑒定［J］.生物化學與生物物理進展，2005,32(2): 140-146.

　　［3］Bai X, Zhou D, Brown JR, et al. Biosynthesis of the linkage region of glycosaminoglycans: cloning and activity of galactosyltransferase Ⅱ, the sixth member of the beta 1,3�瞘alactosyltransferase family(beta 3GalT6)［J］. J Biol Chem，2001，276(51): 48189-48195.

　　［4］Ishida H, Togayachi A, Sakai T, et al. A novel beta1,3�睳�瞐cetylglucosaminyltransferase(beta3Gn�睺8), which synthesizes poly�睳�瞐cetyllactosamine, is dramatically upregulated in colon cancer［J］. FEBS Lett, 2005, 579(1): 71-78.

　　［5］Hassan H, Reis CA,Bennett EP, et al. The lectin domain of UDP�睳�瞐cetyl�睤�瞘alactosamine: polypeptide N�瞐cetyl galactosaminyltransferase�睺4 directs its glycopep tide specificities［J］. J Biol Chem, 2000,275(49) : 38197-38205.

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