幽門螺桿菌Cag致病島hp0540基因的克隆表達及其多克隆抗體的制備

【摘要】  目的： 構建幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)Cag致病島(Cag�瞤athogenicity island，Cag�睵AI)編碼的hp0540基因的原核表達系統，并制備其多克隆抗體。方法： 應用PCR技術從Hp11637基因組DNA中擴增hp0540基因片段，克隆至pMD18��2T載體后，進行序列測定，并對其序列進行生物信息學分析;構建pET��28a�瞙p0540原核表達載體，轉化表達宿主菌BL21DE3;經IPTG誘導表達后，SDS-PAGE法鑒定目的蛋白的表達，并以Ni2+�睳TA柱分離純化目的蛋白;將純化蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體并測定抗體效價。結果： 成功克隆了hp0540基因，全長1 086 bp，編碼361個氨基酸，與基因庫公布的其他Hp菌株基因序列的核苷酸同源性為98%。工程菌誘導后SDS�睵AGE顯示新生表達蛋白帶，相對分子質量約為39 000，經Ni2+�睳TA柱純化后可獲得重組蛋白，重組蛋白免疫新西蘭大白兔后獲得效價為1∶160 000的多克隆抗體。結論： 成功構建了hp0540基因的原核表達系統并制備了其多克隆抗體，為研究該基因的功能奠定了基礎。

【關鍵詞】  幽門螺桿菌; Cag致病島; CagI; 多克隆抗體教育類論文發表

　　[Abstract] Objective: To construct the expression system of hp0540 from strain NCTC11637 of Helicobacter pylori(Hp) and prepare the polyclonal antibody serum of CagI. Methods: The hp0540 gene was amplified by PCR with the genomic DNA of Hp NCTC 11637 as template. The plasmid pMD18��2T�瞙p0540 was constructed via T�睞 clone method and sequenced. The sequence of hp0540 was analyzed through bioinformatics approach. The expression vector pET��28a�瞙p0540 was constructed and transformed into E.coli BL21DE3 by molecular cloning method. The protein was expressed and characterized via SDS�睵AGE method after induced by IPTG. The target protein CagI was purified and collected by Ni2+�睳TA agarose. The puried protein was used to immunize rabbit to prepare polyclonal antibody serum. Results: The hp0540 has been cloned successfully. The sequence analysis for hp0540 showed that it shared 98% homology with other strains of Hp in GenBank. The molecular mass of the purified protein was 39 000. The potency of the polyclonal antibody serum was 1∶160 000. Conclusion: We constructed the prokaryotic expression system and prepared the polyclonal antibody serum successfully, which established a foundation for the function investigation of the hp0540.

　　[Key words] Helicobacter pylori; Cag�瞤athogenicity island; CagI; polyclonal antibody

　　幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一微需氧革蘭陰性細菌，世界上有50%人口因感染該菌而導致慢性胃炎、消化性胃潰瘍、胃腺癌、淋巴樣組織瘤等消化道疾病，世界衛生組織于1994年將其列為第一類致癌原[1-3]。高致病性菌株都含有一長度為40 kb的Cag致病島(Cag�瞤athogenicity island，Cag�睵AI)，用以編碼四型分泌系統(type IV secretion system，TFSS)，通過該系統細菌可以把一些諸如細胞毒素抗原(CagA)、空泡毒素A(VacA)、肽聚糖等致病因子注入宿主細胞，并進而引起細胞在增殖、骨架重排、細胞連接、形態延伸與散射等方面的改變[4]。hp0540是Cag�睵AI內的第19號基因，與根癌農桿菌的Ti�睤NA轉運系統中的基因不具有同源性，由hp0540編碼的CagI蛋白是TFSS的一伴侶樣蛋白。有研究表明CagI蛋白可以與新近發現的宿主整合素受體β1發生相互作用，從而影響毒力因子CagA的轉運，但其具體的作用機制及完整的功能尚不清楚[5]。因此，本文通過對Cag�睵AI中的hp0540基因進行克隆表達及其多克隆抗體的制備，將為進一步研究該基因在Hp致病機制中的作用奠定基礎。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 菌株 Hp NCTC11637購自中國預防科學院流行病學研究所,大腸埃希菌DH5α及BL21DE3為江蘇大學醫學技術學院中心實驗室保存。

　　1.1.2 主要試劑和儀器 哥倫比亞培養基、厭氧袋購自OXOID公司;Ex�睺aqDNA聚合酶、dNTP、限制性核酸內切酶EcoRⅠ與XhoⅠ，T4�睤NA連接酶(快速連接試劑盒)、IPTG、2 000 bp、15 000 bp DNA 標準參照物及蛋白質分子量標準(低)均購自TaKaRa公司;10 kb DNA 標準參照物購自TOYOBO;Ni2+NTA購自Qiagen公司;pET28a載體由江蘇大學醫學技術學院中心實驗室保存;PCR基因擴增儀(Mastercycler Gracent，Eppendor公司)、自動凝膠成像系統(美國UVP公司)，其他常規試劑按照《分子克隆實驗指南》配制。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 Hp的培養與鑒定及基因組DNA提取 Hp NCTC11637標準菌株按常規微需氧方法進行培養與鑒定。DNA用常規酚、氯仿抽提法獲得，-20℃保存備用。

　　1.2.2 hp0540基因的克隆及工程菌的構建 根據基因庫中已報道的Hp26695 NC_000915的hp0540基因序列進行信號肽預測，顯示前60 bp編碼信號肽，去除前60 bp后利用軟件Primier5.0設計引物： p1:5′�睞TAGAATTCACAGAAGTAGTAATAACGCTTGAAC��3′(34 bp);p2:5′�睞GACTCGAGTTTGACAATAACTTTAGAGCTAG��3′(34 bp)。在上游引物5′端加EcoR Ⅰ酶切位點;在下游引物5′端加Xho Ⅰ酶切位點。預期的PCR 產物長度為1 086 bp。引物由上海生工生物技術有限公司合成。以HpNCTC11637菌株基因組DNA為模板,按照常規PCR條件進行擴增, 反應體積為50 μl。反應條件: 94℃預變性10 min, 94℃ 50 s, 60℃ 45 s, 72℃ 50 s, 30個循環,最后于72℃延伸10 min。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行分析后，用DNA回收試劑盒進行回收純化。將純化的PCR 產物克隆到載體pMD18��2T上, 連接產物轉化大腸埃希菌DH5a，選擇陽性克隆進行酶切鑒定。用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切鑒定陽性質粒pMD18��2T�瞙p0540,雙酶切得到目的基因片段,然后連接到原核表達載體pET28a，連接產物轉化大腸埃希菌BL21DE3,酶切鑒定陽性重組質粒pET28a�瞙p0540獲得重組工程菌。

　　1.2.3 DNA序列測定分析及編碼蛋白特性預測 將經過鑒定的陽性重組質粒寄至上海生工測序。基因片段的同源性分析使用NCBI 的Blast在nr數據庫中對基因的同源性進行比對分析; 應用軟件DNAStar分析hp0540編碼氨基酸序列的理化特性。登陸SMART數據庫預測與CagI(hp0540)具有相互作用的蛋白并進行同源性比對。

　　1.2.4 目的蛋白的表達純化與抗體的制備 取經酶切鑒定構建成功的重組工程菌,接種于含卡那霉素的3 ml LB液體培養基中,在37℃振蕩培養至光密度D(600 nm)為0.6時，以不同濃度的IPTG誘導不同的時間后收集菌液,用PBS洗滌3 次, SDS�睵AGE檢測,以未經轉化的大腸埃希菌BL21DE3及轉化空載體pET28a誘導的菌液為陰性對照。確定表達的最佳條件后，大量誘導工程菌，按鎳柱Ni2+�睳TA 純化目的蛋白步驟提取重組蛋白。以純化蛋白為抗原加弗氏佐劑免疫新西蘭大白兔制備兔抗重組蛋白多克隆抗體血清，以ELISA鑒定其免疫性。

　　2 結 果教育類論文發表

　　2.1 Hp的分離培養與鑒定

　　培養96 h后的NCTC11637經革蘭染色，在油鏡下可見海鷗狀、弧形、s形的革蘭陰性菌，尿素酶、氧化酶、觸酶試驗均陽性。

　　2.2 hp0540基因PCR擴增結果

　　PCR結果顯示在1 086 bp附近出現了條帶(圖1)，與預期大小相符，無非特異性條帶。

　　2.3 TA克隆重組質粒的篩選與鑒定

　　將膠回收后的PCR產物與pMD18��2T載體連接，產物轉化至感受態大腸埃希菌DH5α，涂板、37℃培養12 h后隨機挑取單菌落搖菌，提取質粒，雙酶切鑒定產物，電泳結果顯示在3 000 bp與1 086 bp左右出現條帶(圖2)。

　　M：10 kb DNA標準參照物; 1：EcoR Ⅰ單酶切鑒定pMD18��2T�瞙p0540; 2：EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定pMD18��2T�瞙p0540;3：PCR產物

　　2.4 重組表達質粒的酶切鑒定

　　將酶切鑒定為陽性的TA質粒與pET28a載體分別用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，回收目的片段，16℃連接過夜后轉化至感受態大腸埃希菌Bl21DE3，涂板、37℃培養12 h，隨機挑取單菌落搖菌，提取質粒，雙酶切鑒定產物電泳結果顯示大約在5 000 bp與1 086 bp處出現條帶(圖3)。

　　M1：2 000 bp DNA標準參照物; 1：PCR 產物; 2：EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定pET28a�瞙p0540; 3：EcoR Ⅰ單酶切鑒定pET28a�瞙p0540; M2：15 000 bp DNA標準參照物

　　2.5 hp0540基因片段的序列測定及編碼蛋白的理化特性預測

　　將鑒定后的重組質粒送往上海生工進行核苷酸序列測定，DNA測序結果表明，構建的重組質粒上的hp0540長度為1 086 bp，與設計序列大小完全一致。將測得序列分別與已知的兩種國際標準菌株Hp26695和J99的hp0540基因的核苷酸序列進行比對，同源性分別為98%(1067/1086)、 98%(1066/1078)。應用DNAStar軟件分析得到CagI(hp0540)的相對分子質量為39 377，等電點PI為5.35。應用Jameson�瞁olf法對其抗原性進行了分析(圖4)。登錄SMART數據庫進行的相關蛋白預測顯示：CagI蛋白可能與致病島中的CagL(0.869)、CagH(0.831)、CagA(0.800)、CagG(0.774)、CagF(0.613)、CagE(0.613)、CagD(0.594)、CagC(0.594)等蛋白(括號內為可信度)具有相互作用。

　　2.6 目的蛋白在大腸埃希菌中的表達

　　將重組質粒pET28a�瞙p0540 轉化大腸桿菌BL21DE3,經IPTG誘導表達,收集菌液進行SDS�睵AGE電泳檢測。結果顯示在大約40 000 處有特異性條帶(圖5) ，與預期大小一致,而作為對照的宿主菌與pET28a空質粒宿主菌在相應位置未見到蛋白條帶。

　　M：蛋白標準參照物;1：E.coli BL21DE3 菌株;2：轉化了pET28a空載體的E.coli BL21DE3;3：轉化了重組質粒卻未經IPTG誘導的E.coli BL21DE3;4、5：轉化了重組質粒并經IPTG誘導的E.coli BL21DE3

　　2.7 多克隆抗體的制備與效價測定

　　將純化蛋白免疫家兔，獲得抗CagI多克隆抗體，以免疫之前兔的血清作為陰性對照，對抗體進行倍比稀釋后做ELISA，測得抗體效價為1∶160000。

3 討 論

　　在幽門螺桿菌的致病機制中，由Cag致病島編碼的蛋白所組成的TFSS構成了其最重要的致病因子之一[6-9]。除幽門螺桿菌外，TFSS還存在軍團桿菌屬、巴爾通(氏)體屬、博德特氏菌屬等病原菌中，在這些病原菌中TFSS擁有的一個共同功能就是可以將一些致病因子轉移至宿主細胞，進而引發相應的疾病[10-12]。在幽門螺桿菌致病機制的前期研究中，已經表明四型分泌系統的伴侶樣蛋白CagL可與宿主細胞表面的整合素a5β1受體發生相互作用，從而啟動細菌主要毒力因子CagA的轉運，并激活細胞內的信號級聯放大反應，進而引起一系列的病理變化[6]。最新的研究揭示了CagA的轉運還依賴于宿主細胞的另一整合素受體β1， Jiménez�睸oto等[5]已通過酵母雙雜交的方法證實了CagA的N端，CagY(hp0527)的C端及CagI(hp0540)均與整合素β1具有相互作用。教育類論文發表

　　隨著伴侶樣蛋白CagL可啟動細菌主要毒力因子CagA轉運的發現，伴侶樣蛋白在致病機制中的作用已逐漸引起了重視。幽門螺桿菌CagA蛋白轉運的伴侶樣蛋白除CagL與CagI外，還包括CagZ(hp0526)、CagU(hp0531)、CagM(hp0537)、CagN(hp0538)、CagG(hp0542)、CagF(hp0543)、CagD(hp0545)。Fischer等[13]的研究表明，在這些蛋白中，CagZ與CagI對于CagA轉運是必需的，但對IL��8的誘導并不產生影響，而CagN、CagG、CagF、CagD對CagA的轉運與IL��8的誘導都是必需的，可能與這幾種蛋白具有穩定TFSS結構的功能有關。另有研究表明CagM對于hp0532基因的表達具有調節作用，而對CagU蛋白的功能研究卻未見報道。目前，對于這些基因的研究尚不夠深入與全面，而全面地揭示這些基因的功能，對于更好地認識幽門螺桿菌的致病機制及其四型分泌系統的結構都極為必要。

　　本研究成功地克隆了幽門螺桿菌NCTC11637的hp0540基因，并制備了CagI蛋白的多克隆抗體。DNA測序后的序列比對結果表明，該基因具有高度保守性，與Hp其他菌株的同源性達到了98%。在SMART數據庫進行的相關蛋白預測顯示，CagI可能與致病島中的CagL、CagH、CagA、CagG、CagF、CagE、CagD、CagC等蛋白具有相互作用。這將為進一步研究該基因對CagA的轉運、TFSS的組裝及其致病相關因子的相互作用奠定了基礎，從而更好地揭示該基因在幽門螺桿菌致病機制中的作用。

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