SDF��1/CXCR4拮抗劑AMD3100 應(yīng)用方面的研究進(jìn)展

【摘要】  AMD3100是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子��1(SDF��1)受體CXCR4阻斷劑，能有效阻斷SDF��1/CXCR4軸的生理功能;SDF��1/CXCR4軸在介入干細(xì)胞動員、遷移、歸巢，胚胎發(fā)育，免疫調(diào)節(jié)，炎癥反應(yīng)，免疫性疾病，HIV感染，腫瘤細(xì)胞的生長遷移等等方面起重要作用。AMD3100能夠快速有效動員骨髓造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，阻斷HIV��1感染T淋巴細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，抑制某些炎癥性和免疫性疾病進(jìn)展。因此對AMD3100的深入研究將有助于臨床安全有效動員干細(xì)胞用于損傷組織的修復(fù)，能夠?yàn)榕R床治療HIV��1感染和某些腫瘤提供新的途徑。該文綜述了AMD3100應(yīng)用方面的研究進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】  AMD3100;SDF��1 ;CXCR4;動員;綜述文獻(xiàn)

AMD3100(商品名為Plerixafor)是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子��1(SDF��1)受體CXCR4 的非肽類阻斷劑,人類對AMD3100的研究源于其對HIV��1的抗感染作用，后來人們通過研究其抗HIV��1感染作用機(jī)理發(fā)現(xiàn)AMD3100能特異性與CXCR4結(jié)合,阻斷SDF��1/CXCR4軸參與的生理過程，由此人類對AMD3100的研究進(jìn)入了新的階段。目前人們發(fā)現(xiàn)AMD3100能夠快速有效的動員造血干/ 祖細(xì)胞[1]、在介入HIV 病毒感染T細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移、炎癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和哮喘等方面都有重要作用。本文就AMD3100近10年來應(yīng)用方面的研究進(jìn)展作一綜述如下。

　　1 AMD3100的生物學(xué)作用基礎(chǔ)

　　SDF��1是一種CXC亞家族趨化因子,被命名為CXCL12 ,種群間保守性極強(qiáng), 鼠和人的SDF��1氨基酸序列有99%相同。編碼區(qū)含267bp,編碼89 個氨基酸殘基多肽。SDF��1最初被認(rèn)為是B 系祖細(xì)胞的生長因子，與其它因炎癥誘導(dǎo)產(chǎn)生的趨化因子不同,SDF��1由骨髓基質(zhì)細(xì)胞、骨髓內(nèi)皮細(xì)胞等持續(xù)產(chǎn)生,并在胚胎生長發(fā)育期,為B淋巴細(xì)胞的生成、骨髓髓系細(xì)胞的生成、神經(jīng)元形成和心血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)展所必須[2]。英語論文發(fā)表

　　SDF��1的趨化作用由其受體CXCR4介導(dǎo)，SDF��1與CXCR4結(jié)合相互作用才能啟動下游信號通路。CXCR4具有類似于IL��8 受體的結(jié)構(gòu),因其順序與其它CXC 趨化因子受體基因類似,故稱其為CXCR4 。CXCR4 廣泛的表達(dá)在血液、免疫和中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞上。CXCR4是一種與G蛋白偶聯(lián)而介導(dǎo)信號傳導(dǎo)途徑的7�部缒な荏w，它能夠通過增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度來傳遞信號，有強(qiáng)效淋巴細(xì)胞趨化活性。SDF��1/CXCR4軸是造血干細(xì)胞動員、遷移、歸巢的關(guān)鍵性因素[3]，在胚胎發(fā)育，免疫調(diào)節(jié)，炎癥反應(yīng)，免疫性疾病，HIV感染，腫瘤細(xì)胞的遷移等方面也起重要作用。

　　AMD3100是一種人工合成的大環(huán)類SDF��1受體CXCR4特異性拮抗劑，AMD3100可有效地與CXCR4結(jié)合阻斷SDF��1與CXCR4之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)但不能對CXCR4產(chǎn)生激動作用，這是AMD3100發(fā)揮生物學(xué)作用的基礎(chǔ)。CXCR4受體的配體主要結(jié)合位點(diǎn)為第Ⅳ和第Ⅵ跨膜區(qū)的Aspl71與Asp262及位于第Ⅶ跨膜區(qū)的Glu288，其中Glu288為AMD3100阻斷SDF��1結(jié)合的主要位點(diǎn)。

　　2 AMD3100在干細(xì)胞/組細(xì)胞動員中的作用

　　CXCR4在造血干/祖細(xì)胞上高表達(dá)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)分泌的SDF��1對這類細(xì)胞具有很強(qiáng)的趨化性，SDF��1/CXCR4在干細(xì)胞的遷移與歸巢中起著非常重要的作用[1]。干細(xì)胞歸巢和植入與白細(xì)胞遷移至炎癥部位或淋巴細(xì)胞歸巢至淋巴結(jié)相似，該過程中，造血干/祖細(xì)胞需跨越血管內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)入骨髓龕位，在此與基質(zhì)細(xì)胞作用并在黏附分子、SDF��1及生長刺激因子作用下進(jìn)行自我更新和增殖分化，從而實(shí)現(xiàn)了歸巢和植入。E選擇素和P選擇素介導(dǎo)干細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞層的滾動，隨后內(nèi)皮細(xì)胞分泌的SDF��1激活CXCR4干細(xì)胞并觸發(fā)了LFA��1/ICAM和VLA��4/VCAM��1間作用而使干細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞上，而VLA��4和vLA��5與細(xì)胞外基質(zhì)纖維結(jié)合素的作用使干細(xì)胞穿過細(xì)胞外基質(zhì)并順著SDF��1濃度梯度遷移至骨髓龕位[3]。可見SDF��1/CXCR4相互作用始終貫穿于歸巢和植入過程并起著決定性作用。動員則是和歸巢相反的過程，可能是一個多步驟過程，在細(xì)胞因子和趨化因子作用下，介導(dǎo)造血干細(xì)胞錨定于骨髓基質(zhì)細(xì)胞的黏附分子被破壞，其中SDF��1/CXCR4是該過程的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子[3]。

　　AMD3100作為SDF��1/CXCR4軸的特效拮抗劑能夠有效阻斷SDF��1與CXCR4的相互作用而對CXCR4又沒有激動作用，這就使得AMD3100理論上可能成為一種有效的干細(xì)胞動員劑，為某些需要采用干細(xì)胞/祖細(xì)胞移植治療的疾病提供足夠的干細(xì)胞來源。Fruehauf 等[4]報道,在MM和NHL患者動員時,聯(lián)合應(yīng)用AMD3100+G�睠SF比單用G�睠SF動員干細(xì)胞的效果更好。在另外一些學(xué)者的研究中，A+G動員方案的有效性和安全性都優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用G�睠SF動員方案[5]。在單獨(dú)應(yīng)用AMD3100動員干細(xì)胞方面，Devine等[6]的研究認(rèn)為單獨(dú)獨(dú)應(yīng)用AMD3100也能快速而有效的動員造血干細(xì)胞到外周血。Hess等[7]的研究則表明AMD3100對造血干/祖細(xì)胞的動員能力優(yōu)于造血干/祖細(xì)胞的動員“金標(biāo)準(zhǔn)”——單獨(dú)應(yīng)用G�睠SF或者聯(lián)合應(yīng)用G�睠SF與其增效劑。近幾年來有研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)同樣表達(dá)CXCR4，而且通過短期的細(xì)胞因子刺激能夠上調(diào)BMSCs上CXCR4的表達(dá)，SDF��1/CXCR4軸在BMSCs遷移和歸巢中扮演非常重要的角色[8],這表明AMD3100同樣具備動員BMSCs的能力。正是由于大量的臨床研究證明AMD3100是一種比G�睠SF更加有效而安全的干細(xì)胞動員劑，2008年12月18日美國FDA批準(zhǔn)Genzyme公司生產(chǎn)的AMD3100的注射劑作為一種罕用藥上市，用于需要接受干細(xì)胞骨髓移植的多發(fā)性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤等成年腫瘤患者的干細(xì)胞動員和移植環(huán)節(jié)，隨著該藥的正式上市，AMD3100的臨床應(yīng)用研究將會被推向新的深度，其應(yīng)用前景將更加廣闊。

　　AMD3100對造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的動員機(jī)制目前已基本闡明，AMD3100的這一作用源于其對SDF��1/CXCR4軸的阻斷作用。Simon 等[9]的研究證實(shí),AMD3100 作為SDF��1 配體綁定的特異性拮抗劑,其對CXCR4的阻斷作用是慢性可逆的，AMD3100通過阻斷SDF��1/ CXCR4的相互作用與信號傳遞,并協(xié)同性下調(diào)黏附分子的表達(dá)，使得骨髓微環(huán)境中高表達(dá)的SDF��1對造血干/ 祖細(xì)胞失去了趨化性，造血干/ 祖細(xì)胞無法順著SDF��1濃度梯度進(jìn)行跨內(nèi)皮細(xì)胞移行并遷移至骨髓龕位，從而達(dá)到動員骨髓造血干/祖細(xì)胞進(jìn)入外周血循環(huán)的效果。而目前臨床上的“金標(biāo)準(zhǔn)”動員劑G�睠SF動員骨髓造血干/祖細(xì)胞進(jìn)入外周血的機(jī)制則并未完全闡明。

　　3 AMD3100在腫瘤治療中的作用

　　腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞具有某些共性，比如分化程度低、生長迅速、易于遷移等。一些研究表明，某些腫瘤細(xì)胞上也高表達(dá)CXCR4，而某些高表達(dá)SDF��1的器官或組織往往成為這些腫瘤細(xì)胞的優(yōu)先轉(zhuǎn)移目的地[10]，表明腫瘤細(xì)胞在遷移機(jī)制方面似乎也具有共性，SDF��1/CXCR4在腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移中可能也扮演著非常重要的角色。已有研究證實(shí)SDF��1/CXCR4軸在卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移中起非常重要的作用，而AMD3100則能夠明顯抑制這類癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[11]。Kawaguchi等[12]研究發(fā)現(xiàn)SDF��1/ CXCR4軸在SCID小鼠成人白血病(ATL)模型中淋巴瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移起重要作用，AMD 3100能夠明顯抑制淋巴瘤細(xì)胞向肝、肺、脾等組織的轉(zhuǎn)移，在研究人類ATL患者的淋巴瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中，他們得出了同樣的結(jié)果。另外有些研究還顯示AMD3100能夠通過下調(diào)VEGF和MMP��9的表達(dá)而抑制直腸結(jié)腸癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力[13]，表明AMD3100除了通過阻斷SDF��1/CXCR4軸外還能通過其他機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移能力。最近Azab等[14]的研究發(fā)現(xiàn)AMD3100還能夠通過將某些腫瘤細(xì)胞動員到周圍循環(huán)中，破壞腫瘤賴以生長的微環(huán)境，從而增加腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞毒藥物的敏感性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。這為AMD3100應(yīng)用于腫瘤治療方面提供了一種新的思路，AMD3100可作為細(xì)胞毒藥物的輔助劑或者增強(qiáng)劑應(yīng)用于腫瘤治療。英語論文發(fā)表

　　在利用AMD3100抑制腫瘤細(xì)胞的生長轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)治療某些腫瘤方面還存在一些不確定性。Kim等[15]在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AMD3100除了能明顯抑制SDF��1、引起的骨髓瘤細(xì)胞遷移之外，在一定條件下還有刺激骨髓瘤細(xì)胞生長的作用，這表明AMD3100治療腫瘤的安全性還有待進(jìn)一步研究。

　　4 AMD3100在HIV感染中的作用

　　HIV��1感染機(jī)體首先以CXCR5為輔佐受體感染單個核細(xì)胞，該期患者多無明顯臨床癥狀，隨后再感染CD4+T 細(xì)胞，此期表現(xiàn)出獲得性免疫缺陷綜合征。SDF��1受體CXCR4為HIV��1感染CD4+T細(xì)胞的共同受體與融合素，能夠與CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同作用,參與HIV��1表面糖蛋白gp120與CD4+抗原的結(jié)合，介導(dǎo)HIV��1病毒侵入CD4+T細(xì)胞,HIV��1病毒能夠與CXCR4 的N�捕说亩鄠�結(jié)構(gòu)域結(jié)合。SDF��1和AMD3100與CXCR4的結(jié)合能阻斷受體與HIV 的結(jié)合位點(diǎn)防止HIV��1 進(jìn)入細(xì)胞而發(fā)揮抗HIV��1感染作用。Fransen等[16]研究發(fā)現(xiàn)AMD3100能夠有效的抑制這種通過CXCR4感染的HIV��1病毒, AMD3100抑制HIV��1病毒感染的IC50值為1～10mg/L。但應(yīng)用高劑量AMD3100時會引起心臟不良反應(yīng)，故目前對AMD3100用于此適應(yīng)證的研究已經(jīng)被終止。AMD3100在抗HIV��1感染方面的研究與應(yīng)用將被具有可選擇性阻斷gp120與CXCR4的相互作用而不妨礙CXCR4與天然配體的結(jié)合和下游區(qū)域信號的產(chǎn)生的衍生物所取代。

　　5 AMD3100在炎性疾病和免疫性疾病中的作用

　　SDF��1/CXCR4軸在很多免疫性疾病和炎性疾病中都起作非常重要的作用，早在2000年Gonzalo等[17]就發(fā)現(xiàn)其在ADD發(fā)病中起著關(guān)鍵作用作用;而Xu等[18]的研究則表明SDF��1/CXCR4軸在肺損傷和纖維化的病理過程中起著非常重要的作用。2002年Lukacs等[19]應(yīng)用AMD3100治療肺及呼吸道的過敏性炎性疾病，發(fā)現(xiàn)其在動物體內(nèi)能夠抑制這類炎癥反應(yīng)，說明AMD3100在治療某些炎性疾病時是有效的。而Watanabe等[20]在博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型上在用博來霉素處理的同時應(yīng)用AMD3100,發(fā)現(xiàn)AMD3100對小鼠的肺纖維化進(jìn)程有明顯的抑制作用,當(dāng)在應(yīng)用博來霉素處理小鼠發(fā)生肺部損傷之后再用AMD3100處理則加快了小鼠的肺纖維化進(jìn)程，這說明AMD3100在治療某些炎性疾病時可能具有雙重性，其安全性有待進(jìn)一步的研究。

　　大量研究表明，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)滑膜上SDF��1表達(dá)增高,在滑膜內(nèi)有表達(dá)CXCR4的T細(xì)胞大量聚集[21]，說明SDF��1/CXCR4軸參與RA的發(fā)病。另有研究發(fā)現(xiàn)SDF��1在強(qiáng)直性脊柱炎患者滑膜成纖維細(xì)胞和滑膜組織表達(dá)增多,提示SDF��1/ CXCR4軸在強(qiáng)直性脊柱炎病變的發(fā)展與持續(xù)中可能起重要作用。Matthys等[22]研究發(fā)現(xiàn)AMD3100能夠有效的抑制IFN�拨檬荏w缺陷的小鼠自身免疫性關(guān)節(jié)炎，說明AMD3100對上述免疫性疾病有明顯的抑制作用，但由于這類疾病往往需要長期用藥，而長期應(yīng)用AMD3100會對SDF��1/ CXCR4軸的正常生理功能產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾，引起較多的不良反應(yīng)。因此AMD3100治療上述免疫性疾病的應(yīng)用前景并不樂觀。
6 結(jié)語

　　由于在抗HIV��1感染、治療炎性反應(yīng)和免疫性疾病方面，長期應(yīng)用AMD3100引起多方面的副作用，故目前該藥主要應(yīng)用于干細(xì)胞動員和某些腫瘤疾病的治療領(lǐng)域。干細(xì)胞具有多向分化的潛能，在組織的修復(fù)與重建方面具有廣闊的前景，利用干細(xì)胞移植修復(fù)某些損傷性組織已經(jīng)成為目前干細(xì)胞研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，目前這方面的研究主要是采用異體干細(xì)胞移植和自體干細(xì)胞體外培養(yǎng)、擴(kuò)增或者預(yù)處理后回植。而動員干細(xì)胞是應(yīng)用干細(xì)胞修復(fù)損傷組織的前提，AMD3100動員骨髓干細(xì)胞安全而有效，使得其在損傷組織修復(fù)方面具有應(yīng)用前景。目前已有研究發(fā)現(xiàn)AMD3100可以用于血管損傷的修復(fù)[23]，但AMD3100能否用于其它損傷組織的修復(fù)?采用什么方法用于這些損傷組織的修復(fù)?這些方面的問題有待人們更深入的研究。

【參考文獻(xiàn)】英語論文發(fā)表
  　[1] Broxmeyer H E, Orschell C M, Clapp D W, et al. Rapid mobilization of murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with AMD3100, a CXCR4 antagonist[J]. J Exp Med, 2005,201(5): 1307 �� 1318.

　　[2] Falco D E, Porcelli D. SDF��1 involvement in endothelial phenotype and ischemia �瞚nduced recruitment of bone marrow progenitor cells[J].Blood,2004, 104(12): 3482��3483.

　　[3] Lund T, Glass T, Tolar J, et al. A model system for Visualization of whole�瞓ody SDF��1 expression during hematopoietic cell transplant[J].Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), 2009,114: 3623.

　　[4] Fruehauf S ,Seeger T , Maier P , et al. The CXCR4 antagonist AMD3100 releases a subset of G�睠SF�瞤rimed peripheral blood progenitor cells with specific gene expression characteristics[J]. Exp Hematol ,2006 ,34 (8):1052��1059.

　　[5] Holtan S G, Porrata L F , Micallef I N ,et al. AMD3100 affects autograft lymphocyte collection and progression�瞗ree survival after autologous stem cell transplanttation in non�睭odgkin lymphoma [J]. Clin Lymphoma Myeloma, 2007 ,7 (4) :315��318.

　　[6] Devine S M, Vij R, Rettig M,et al.Rapid mobilization of functional donor hematopoietic cells without G�睠SF using AMD3100, an antagonist of the CXCR4/SDF��1 interaction[J] . Blood, 2008,112(8): 990 �� 998.

　　廣 東 醫(yī) 學(xué) 院 學(xué) 報 2010年第28卷 第2期 周瑞明，等.SDF��1/CXCR4拮抗劑AMD3100 應(yīng)用方面的研究進(jìn)展[7] Hess D A, Bonde J, Craft T C, et al. Human progenitor cells rapidly mobilized by AMD3100 repopulate NOD/SCID mice with increased frequency in comparison to cells from the same donor mobilized by granulocyte colony stimulating factor[J]. Biol of Blood Marrow Transplant ,2007,13(4):398��411.

　　[8] Shi M, Li J, Liao L, et al.Regulation of CXCR4 expression in human mesenchymal stem cells by cytokine treatment: role in homing efficiency in NOD/SCID mice[J]. Haematologica, 2007,92(7): 897 �� 904.

　　[9] Simon P F , Anastassov V , Cox J , et al. Characterization of the molecular pharmacology of AMD3100 :a specific antagonist of the G�瞤rotein coupled chemokine receptor , CXCR4[J]. Biochem Pharmacol,2006 , 72(5):588��596.

　　[10] Muller A,Homey B,Soto H,et al.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis[J]. Nature , 2001,410 (6824) :502��506.

　　[11] Kajiyama H , Shibata K, Terauchi M , et al. Involvement of SDF��1a/CXCR4 axis in the enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma[J]. Int J Cancer,2008, 122(6) :91��99.

　　[12] Kawaguchi A, Orba Y, Kimura T, et al. Inhibition of the SDF��1α�睠XCR4 axis by the CXCR4 antagonist AMD3100 suppresses the migration of cultured cells from ATL patients and murine lymphoblastoid cells from HTLV�睮 Tax transgenic mice[J] .Blood, 2009,114(10): 2961��2968.

　　[13] Li J K, Yu L, Shen Y,et al. Inhibition of CXCR4 activity with AMD3100 decreases invasion of human colorectal cancer cells in vitro[J]. World J Gastroenterol, 2008,14(15): 2308��2313.

　　[14] Azab A K, Runnels J M, Pitsillides C, et al.CXCR4 inhibitor AMD3100 disrupts the interaction of multiple myeloma cells with the bone marrow microenvironment and enhances their sensitivity to therapy[J]. Blood, 2009,113(8): 4341��4351.

　　[15] Kim H Y, Kim S W, Lee H J, et al.The CXCR4 antagonist AMD3100 stimulates the sroliferation of syeloma sells[J]. Blood (ASH Annual Meeting Abstracts), 2008,112(11): 1701.

　　[16]Fransen S, Bridger G, Whitcomb J M , et al. Supression of dualtropic human immunodeficiency virus type 1 by the CXCR4 antagonist AMD3100 is associated with efficiency of CXCR4 use and baseline virus composition[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2008,52(7) :2608��2615.

　　[17]Gonzalo K A,Lloyd C M,Peled A,et al.Critical involvement of the chemotactic axis CXCR4/SDF��1αin the inflammatory component of the allergic airway disease[J].J Immunol,2000 ,165(1):499��508.英語論文發(fā)表

　　[18] Xu J G, Mora A, Shim H ,et al.role of the SDF��1/CXCR4 axis in the pathogenesis of lung injury and fibrosis[J].Am J Respir Cell Mol Biol, 2007,37(9): 291��299.

　　[19] Lukacs N W, Berlin A, Schols D, et al. AMD3100, a CXCR4 antagonist, attenuates allergic lung inflammation and airway hyperreactivity[J] .Am J Patho, 2002, 160(8): 1353��1360.

　　[20] Watanabe M, Matsuyama W, Shirahama Y, et al.Dual effect of AMD3100, a CXCR4 antagonist, on bleomycin�瞚nducedlung inflammation[J]. J Immunol,2007, 178(5): 5888 ��5898.

　　[21] Buckley C D, Amft N, Bradfield P F, et al. Persistent Induction of the Chemokine Receptor CXCR4 by TGF��?1 on Synovial T Cells Contributes to Their Accumulation Within the Rheumatoid Synovium[J]. J Immunol, 2000,165(9): 3423��3429.

　　[22] Matthys P, Hatse S, Kurt Vermeire, ,et al.AMD3100, a potent and specific antagonist of the stromal cell�瞕erived factor��1 chemokine receptor CXCR4, Inhibits autoimmune joint inflammation in IFN�拨胷eceptor�瞕eficient mice[J]. J Immunol, 2001,167(10): 4686��4692.

　　[23] Shepherd R M, Capoccia B J, Devine S M, et al. Angiogenic cells can be rapidly mobilized and efficiently harvested from the blood2following treatment with AMD3100[J]. Blood, 2006,108(12):3662��3667.