血液中大腸埃希菌超廣譜β-內酰胺酶耐藥基因型研究

【摘要】  目的 了解本地區血液標本中產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)大腸埃希菌的分離率、耐藥性和基因型。方法 收集臨床血液標本分離的產ESBLs的大腸埃希菌26株，應用PCR基因擴增技術分別檢測SHV、TEM、CTX-M、PER、CTX-M-2、Ampc、GES基因，DNA測序確定CTX-M、TEM基因型。結果 在26株菌株中15株為CTX-M型,占57.69%，11株為TEM型,占42.31%。結論 本地區臨床血液標本分離的產ESBLs大腸埃希菌流行的主要基因型是CTX-M型和TEM型。

【關鍵詞】  大腸埃希菌；超廣譜β-內酰胺酶；基因型；血液標本

　　Abstract: Objective  To investigate the isolation rate, antibiotic susceptibility and ESBLs′ genotypes of the Escherichia coli strains isolated from local blood samples. Methods  26 clinical strains of E.Coli expressing ESBLs isolated from blood were collected. The genotypes of  SHV, TEM, CTX�睲, PER, CTX�睲��2, AmpC and GES genes were analyzed by PCR and CTX�睲, TEM genotype  were determined by DNA sequencing.Results  There were 15 strains expressing blaCTX�睲 gene and 11 strains expressing blaTEM gene among 26 strains.Conclusion  Results shows that CTX�睲�瞭ype and TEM�瞭ype are predominant genotypes of ESBLs in E.coli strains isolated from local blood samples.

　　Key words: escherichia coli; ESBLs; genotype; blood sample音樂論文發表

　　超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum-laetamases，ESBLs)主要由腸桿菌科的細菌產生,以大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為代表［1］，是臨床腸桿菌科細菌對第三代頭孢菌素耐藥的重要機制。ESBLs型細菌對多種抗生素耐藥,易引起醫院院內暴發流行，血液中一旦出現產ESBLs的大腸埃希菌，可引起多器官甚至全身感染，給臨床治療帶來極大困難，因此進行本地區臨床血液標本中分離的ESBLs型菌的耐藥性監測及耐藥分子流行病學研究，對血液流行感染性疾病的預防控制尤為重要。由于抗生素使用情況差異，不同國家、地區ESBLs種類不同，國內報道以SHV和CTX-M型較為常見［2-3］，為了解本地區血流感染ESBLs型大腸埃希菌的耐藥情況，對寧夏醫科大學附屬醫院2005年1月至2008年5月臨床血液標本分離的26株ESBLs陽性菌株耐藥性和基因型報告如下。

　　1  材料

　　1.1  菌株來源

　　臨床血液標本中連續分離出無重復（同一患者同一部位只取第一次分離標本）26株ESBLs陽性菌株。

　　1.2  主要試劑

　　分離鑒定培養基、M-H瓊脂干粉和藥敏紙片（英國 Oxoid 公司）；2000 DNA Marker、蛋白酶K、Takara Tag 酶（大連寶生物公司）；引物由上海生物工程公司合成。

　　1.3  主要儀器

　　VITEK-32全自動微生物分析儀（法國生物梅里埃公司）；DB-920全自動血培養儀；ND-1000核酸蛋白測定儀（美國Nano Drop公司）；Eppendorf  PCR儀（德國）；電泳儀、凝膠成像分析系統（美國Bio-Rad公司）。

　　2  方法

　　2.1  菌株鑒定

　　所有菌株采用法國生物梅里埃公司VITEK-32全自動微生物分析儀鑒定及藥敏試驗鑒定菌種，得到初步ESBLs的結果。

　　2.2  ESBLs確證試驗

　　采用美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）推薦的紙片擴散法進行ESBLs表型確證［4］，質控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

　　2.3  藥敏試驗

　　按K-B法將待測菌液接種M-H平皿上，貼上抗生素紙片，35℃培養18-24h，測量抑菌圈直徑，按CLSI標準判斷敏感率(S)、中介率（I）、耐藥率(R)，共采用15種抗生素。

　　2.4  細菌質粒DNA的提取

　　采用傳統的煮沸法提取質粒DNA［5］，調整菌液的濃度使得OD260/OD280在0.4～0.6之間，作為模板液備用。

　　2.5  設計靶基因PCR擴增反應體系

　　總反應體積25μL，其中10× buffer 2.5μL，dNTP 4μL，primer 0.6×2μL，TaqE 0.4μL，模板1μL，用ddH2O補足至25μL。熱循環參數為:預變性(94℃ 10min) →變性（94℃ 30s）→退火→延伸（72℃ 60s）,循環35周期, 最后1個72℃延長至5min。反應的退火溫度根據每對上下游引物單獨設計。靶基因PCR引物序列由上海生物工程公司合成（引物序列見參考文獻［6］）。PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后,用溴化乙錠(10mg/mL)染色，凝膠成像系統進行結果分析。各種靶基因引物序列和目的產物長度見表1。

　　2.6  PCR產物的基因測序

　　隨機抽取各基因型陽性菌株2株，用美國應用生物系統公司ABI377自動DNA測序儀進行序列分析(由北京諾賽基因測序公司完成)。DNA測序結果通過美國NCBI網站BLASTN軟件與GenBank數據庫進行比對分析。表1  β-內酰胺酶引物序列（略）

　　3  結果

　　3.1  耐藥率

　　26株產ESBLs酶的大腸埃希菌對15種抗菌藥物耐藥率的分析，見表2。表2  26株產ESBLs菌株對15種抗生素的耐藥情況（略）

　　3.2  基因型檢測結果
 
　　26株產ESBLs大腸埃希菌基因型檢測結果，見表3。ESBLs 的CTX-M、TEM基因型的PCR凝膠電泳見圖1。表3  26株產ESBLs大腸埃希菌基因型檢測結果（略）

　　3.3  基因測序結果 音樂論文發表

　　從TEM和CTX-M陽性菌株中分別隨機選取2株進行測序，測序結果與GenBank報道的序列進行比較，其同源性均達到99%以上。
　4  討論

    ESBLs是存在于細菌中的絲氨酸蛋白酶的衍生物，它能水解β-內酰胺環，尤其是頭孢他啶、頭孢噻肟和氨曲南等廣譜頭孢菌素，可通過質粒形式在細菌之間傳播［7］。自1983年在德國發現第1例ESBLs以來［8］，其發生率呈逐年上升趨勢。至今世界各地已經出現了200多種ESBLs，如美國主要為TEM-2、10，法國主要為TEM-24、TEM-3、SHV-4，而中國主要為SHV、 CTX-M基因型［2-3］。從表2可知，本地區血液中產ESBLs大腸埃希菌中TEM、CTX-M型酶是最常見的β-內酰胺酶，這與國內報道的ESBLs基因型別有一定差別［2-3］。TEM型ESBLs是由產廣譜β-內酰胺酶基因TEM-1型或TEM-2型經過1個或多個位點突變而形成的。本研究檢測到11株產ESBLs的大腸埃希菌帶有TEM型質粒，可能與本地醫院大量使用頭孢他啶有關。CTX-M型ESBLs特征是對頭孢噻肟和頭孢曲松的水解力很強，而對頭孢他啶的水解能力相對較弱。本研究顯示，15株菌帶有CTX-M型質粒，很可能與本地醫院以頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢哌酮等三代頭孢菌素長期大量使用，導致細菌質粒耐藥基因突變或選擇性細菌耐藥株產生有關。另外，本研究可能由于標本量少未檢出其他基因型別，其他型別檢出率低，與參考文獻報道的一致［9-10］。

    從表3可知，本地區血液中產ESBLs大腸埃希菌對亞胺培南和哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率低,分別為0、11.8%，提示臨床治療該菌引起的感染時可以選用以上藥物；對氨曲南、頭孢呋辛、頭孢哌酮、頭孢唑啉等抗生素的耐藥率很高，分別為100%、96.20%、96.20%、92.30%，提示這些菌株可能攜帶ESBLs耐藥基因，在臨床選用治療血液感染時，應盡量避免選用此類抗生素。
    本研究中所檢出血液中大腸埃希菌ESBLs型別主要為TEM、CTX-M。為防止更多的ESBLs基因型別輸入本地或者本地型別輸出，應加強ESBLs型菌耐藥性監測及其分子流行病學研究，指導臨床合理使用抗生素，提高醫院對ESBLs型菌防控意識，將其危害降到最低程度。

【參考文獻】
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　　［2］陳升汶,盧月梅,張阮章,等.大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌產超廣譜β-內酰胺酶基因分型研究［J］.中華檢驗醫學雜志,2006,2(29):166-167.

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　　［6］David L.Paterson, Kristine M.Hujer,Andrea M. Hujer, et al. Extended-Spectrum-Lactamases in Klebsiella pneumonia Bloodstream Isolates from Seven Countries:Dominance and Widespread Preva lence of SHV-and CTX-M-Type-Lactamases［J］. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2003,47(11) :3554-3560.

　　［7］David L. Paterson, Robert A. Extended-spectrumβ-lactamases: a clinical update［J］. Clin Microbiol Rev,2005,18(4):657-686.

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　　［9］季淑娟,顧怡明,譚文濤,等.中國部分地區大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌超廣譜β-內酰胺酶基因型研究［J］.中華檢驗醫學雜志,2004,27(9):590-593.

　　［10］韓珍,李向陽,楊錦紅,等. 臨床產ESBLs大腸埃希菌耐藥表型及基因型的研究［J］.檢驗醫學,2008, 23 (4):397-400.

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