臍血采集后分離時間對單個核細胞玻璃化冷凍效果的影響

【摘要】  目的 探索臍血采集后單個核細胞(MNC)最佳分離和冷凍的時間窗。方法 采集臍血6份，每份按采集后分離時間分為8h組、24h組、48h組和72h組。每組標本均在分離后進行MNC計數及臺盼藍染色檢測細胞活率;各時間組細胞活率在50%以上的行體外CFU形成能力檢測及玻璃化冷凍。冷凍10h后解凍進行細胞活率及體外CFU形成能力檢測。結果 冷凍72h組細胞活率低于其他組(P<0.05);解凍后72h組MNC計數低于24h和48h組(P<0.05);48 h以后分離的MNC解凍后細胞活率降低(P<0.05)。結論 臍血MNC采集后的48h內分離冷凍不影響細胞活率及凍存后集落形成能力。

【關鍵詞】  臍血;分離時間;冷凍效果物理論文發表

             造血干細胞移植是迄今治療慢性粒細胞白血病最有效的方法[1]。臍血庫的建立是臍血造血干細胞能夠廣泛應用于臨床的前提。探索簡便有效的玻璃化凍存方法及低毒的冷凍保護劑已成為臍血干細胞應用的基礎性要求。由于臍血采集的時間存在不確定性，對于在夜晚采集的臍血，通常會保存在4℃冰箱等待分離后凍存。了解4℃冰箱存放時間與單個核細胞(mononuclear cells，MNC)分離后凍存效果的關系將對臨床應用具有指導意義。本實驗對臍血采集后不同時間段的MNC玻璃化凍存前后的細胞活力及集落形成能力進行了檢測，以探索適宜的臍血采集后分離、冷凍時間，為臨床實際應用提供依據。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 臍血標本 均采自寧夏醫科大學附屬醫院婦產科，產婦簽署知情同意書。

　　1.1.2 主要試劑及耗材 Ficall淋巴細胞分離液、干細胞培養液、白細胞介素3、粒巨細胞生長因子、促紅細胞生成素購自sigma公司，丙二醇(propylene glycol, PG)系進口分裝,蔗糖(Sucrose)為國產分析純。采血袋(內含檸檬酸鹽抗凝劑citrate phosphate adenine dextnse, CPD A)、冷凍管、35mm培養皿采用國產產品。

　　玻璃化液：1.0 mol/L的PROH+0.5 mol/L Sucrose+2% Dextran-40;解凍液：50%胎牛血清+1M蔗糖+RPMI 1640

　　1.2 方法

　　1.2.1 實驗分組 采集臍血6份，每份按采集后MNC分離時間分為8h組、24h組、48h組和72h組。每組標本均在分離后進行MNC計數及臺盼藍染色檢測細胞活率，選擇各時間組細胞活率在50%以上的進行體外CFU形成能力檢測及冷凍。冷凍方法采用玻璃化液進行玻璃化冷凍，解凍后進行細胞活率及體外CFU形成能力檢測。

　　1.2.2 臍血采集 用密閉式收集法采集健康孕婦足月順產的新生兒臍帶血(cord blood，CB)。采用 CPD A抗凝的密閉式血袋在胎盤娩出前從臍帶斷端遠離新生兒側采集[2]。采集后4℃保存,根據實驗要求在不同時間點分離。

　　1.2.3 臍血分離 將臍血用無菌的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)等體積稀釋。無菌吸管吸取稀釋后的臍血按1∶1體積，小心疊放在Ficall淋巴細胞分離液層面上，2500 r/min離心30 min，小心吸取中間云霧層細胞，加入磷酸鹽緩沖液，1500 r/min 離心10 min 洗滌2次，徹底棄上清。進行單個核細胞計數和細胞的活率檢測[3]。

　　1.2.4 臍血冷凍 采用兩步滲透平衡法：4℃下將分離的臍血MNC 5份與預滲透保護液1份混合，滲透平衡5min，加入玻璃化冷凍保護液，使細胞懸液的冷凍保護劑達到10%丙二醇(PROH)+10%蔗糖的玻璃化液，在玻璃化液中滲透平衡1 min，投入液氮保存。

　　1.2.5 復蘇方法 樣品分別于凍存10d后復蘇。從液氮中取出冷凍管，在37 ℃水浴中，30 s 內解凍。室溫下加入解凍液。

　　1.2.6 冷凍效果的判斷 通過對冷凍前后細胞存活率及體外GM-CFU形成能力的檢測判斷凍存效果。

　　細胞存活率的檢測采用臺酚藍染色法計算每100個細胞中的活細胞百分率[4]。體外GM-CFU形成能力的檢測參照薛慶善[5]的方法，即培養至15d。顯微鏡下觀察組織生長狀況，以細胞數大于40個的克隆做為一個集落，進行集落計數。

　　1.3 統計學方法

　　各組數據均以均值±標準差(±s)表示，各組間差異比較采用方差分析，用SPSS11.5軟件處理。

　　2 結果物理論文發表

　　各時間組冷凍前MNC計數隨分離時間延長呈現逐漸減少趨勢(圖1，見封4)，72h組的細胞活率明顯低于其他時間組(P<0.05)，細胞活率由48h的(83.33±6.06)%降至(45.83±10.21)%，已不能滿足進行CFU檢測的細胞數量要求。4℃存放48 h后分離的MNC經玻璃化冷凍后細胞活率明顯降低，與其他時間組相比差異有統計學意義(P<0.05)。48h之內冷凍前后均具有克隆形成能力。詳見表1和圖2(見封4)。表1 不同時間點分離及玻璃化凍存后臍血MNC的數量變化、活率及克隆形成能力的比較
3 討論

　　臍血庫的建立可以徹底解決臍血樣本不足的問題，并為尋找適合的配型提供方便。而建立臍血庫關鍵是要盡可能地保證臍血干細胞在冷凍復蘇后各種生物學特性不受損傷，以保持造血干、祖細胞活性，使臍血干、祖細胞移植能重建患者造血功能、免疫功能和干細胞體內外增殖、分化等功能。利用比重介質為1.075～1.090之間的淋巴細胞分離液作密度梯度離心可獲得淋巴細胞、造血干細胞等MNC。由于臍血采集的時間存在不確定性，對于在夜晚采集的臍血，通常會保存在4℃冰箱等待分離后凍存。因此，探索適宜的采集后分離、冷凍時間將為臨床實際應用提供科學依據。

　　有研究者將臍血采集后在4℃冰箱放置4d后發現體外培養細胞集落產率明顯降低[6]，但對于1～4d內不同時間點細胞活力的變化未做進一步研究。也有學者在24h內的不同時間段通過檢測細胞活力及集落形成能力和CD34+回收率作了檢測，發現在4℃下保存臍血24h，細胞功能無明顯影響[7]，但對24h后細胞的變化未做觀察。Broxmeyer[8]等發現在4℃下保存臍血24h后造血細胞功能保存良好，48～72h后存活造血細胞數量明顯減少。

　　本實驗中，采集的臍血在24h之內分離細胞的計數、活率及凍存后細胞活率處于穩定狀態，24～48h呈下降趨勢。48h后各項檢測指標均明顯降低。說明臍血在離開機體內環境24h內，其數目、體外增殖能力以及抗凍能力均保持良好，48h后其功能即出現明顯下降。

　　以上結果表明，臍血采集后的48h內均可進行分離冷凍，但為了保證干細胞的生存質量，建議在24h之內分離凍存為宜。

【參考文獻】
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　　[2] Solves, Moraga R, Saucedo E. Comparison between two strategies for umbilical cord blood collection[J]. Bone Marrow Transplantation, 2003, 31 (4):269-273.

　　[3] 高海燕,李曉鷗,朱　華.不同方法分離人臍血造血細胞的比較研究[J].長春中醫藥大學學報,2008，24(6)：765.

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　　[5] 薛慶善. 體外培養的原理與技術[M]. 北京：科學出版社, 2001：1559-570.

　　[6] 譚運福, 李衛民, 蔣德昭. 細胞因子及4e保存對臍血造血干/祖細胞的影響[J]. 湖南醫科大學學報, 1999, 24(3)：237-238.

　　[7] Szolomicka-Kurzawa P. Improved method for delivery room collection and storage of human cord blood cells for grafting[J]. Ann Acad Med Stetin, 2001, 47:1071.

　　[8] Broxmeyer HE, Douglas GW, Hangoc, et al. Human umbicical cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells[J]. Medical Sciences, 1989，86:3828.

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