口蹄疫病毒VP1基因重組腺病毒的構建與鑒定

【摘要】  目的 構建表達O型口蹄疫病毒( Foot-and-Mouth disease Virus，FMDV)VP1基因的重組腺病毒并對其進行鑒定。方法 將FMDV VP1基因克隆到腺病毒的穿梭載體pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP中。得到的陽性穿梭質粒經PmeⅠ酶線性化后，利用電轉化技術將線性化的陽性質粒與腺病毒骨架載體pAdeno VatorΔE1/E3共轉化大腸桿菌BJ5183感受態細胞，使其在大腸桿菌中進行同源重組。將篩選到的重組病毒質粒經PacⅠ酶線性化后暴露出包裝信號，通過脂質體LipofectamineTM2000轉染HEK-293A細胞后得到重組病毒。利用報告基因GFP和細胞病變檢測重組病毒滴度和感染效率，通過PCR和western-blot檢測FMDV VP1基因在重組腺病毒中的表達。結果 成功構建了表達FMDV VP1基因的重組腺病毒rAd5-VP1，其滴度為1011.87個TCID50/mL。western-blot檢測重組腺病毒rAd5-VP1能與FMDV陽性血清發生反應。結論 重組腺病毒rAd5-VP1能與FMDV陽性血清發生反應，PCR和western-blot檢測FMDV VP1基因在重組腺病毒中穩定表達。

【關鍵詞】  口蹄疫病毒;重組腺病毒;VP1基因教育類論文發表

            口蹄疫(Foot-and-Mouth disease，FMD) 是由O型口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄動物的急性、熱性、高度接觸性傳染病，屬于人畜共患傳染病。該病的流行不僅造成巨大的經濟損失，而且直接影響到國家貿易、人類生活和健康，關系到社會安定和國際聲譽[1]。滅活疫苗的免疫接種是控制該病的主要方法，但只能提供短期保護，而且存在病毒滅活不完全和病毒逃逸的潛在危險，因而基因工程疫苗的研究成為FMD 研究的熱點之一。隨著分子生物學技術的飛速發展，FMD基因工程疫苗等多種新型的疫苗都在不斷的研究開發中，但在動物保護性實驗中的結果并不理想[2-3]。對O型FMDV抗原位點的研究表明，結構蛋白VP1-VP4均參與抗原位點的形成，但發揮主要作用的是VP1。VP1能誘導感染動物產生中和性抗體，它暴露于病毒顆粒的表面，易發生變異，在FMD基因工程疫苗研究中倍受關注[4-5]。本研究通過把O型FMDVVP1基因克隆入腺病毒穿梭載體pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP中，然后與骨架載體pAdeno VatorΔE1/E3在大腸桿菌BJ5183中進行同源重組，構建重組腺病毒并對其進行鑒定，為研究FMDV的重組腺病毒活載體疫苗奠定基礎。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要試劑 腺病毒載體系統包括：穿梭載體pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP和骨架質粒載體pAdeno VatorΔE1/E3、宿主菌DH5α和BJ5183均由南京農業大學農業部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室惠贈。含有O型FMDV VP1基因的質粒pMD18-VP1由本人構建[6]。限制性內切酶PmeⅠ、PacⅠ購自Gene公司，其他限制性核酸內切酶、連接酶、聚合酶、牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)，核酸分子量標準，DNA小量凝膠回收試劑盒均購自大連TaKaRa公司。LipofectamineTM2000購自上海Invitrogen公司，Western印跡試劑盒、HRP-SPA為武漢博士德生物工程有限公司產品;其它試劑均為國產或進口分析純試劑。FMDV 的標準陽性血清為中國農業科學院蘭州獸醫研究所產品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 轉移載體pA5-VP1的構建 以pMD18-VP1為模板，重新設計擴增VP1基因的1對引物(上海Invitrogen公司合成)。

　　P1:5’-CGTAGATCTATGACCACCTCA-3’ (BglⅡ)

　　P2:5’-GCAGATCTCTCGAGTCAAAAAGCTGTTT-3’ (BglⅡ，XhoⅠ)

　　PCR產物和穿梭載體pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP分別經BglⅡ酶切，并于4 ℃過夜連接，氯化鈣法轉化大腸桿菌DH5α。提質粒用XhoⅠ進行酶切鑒定其正反向。將獲得的陽性重組質粒命名為pA5-VP1，送上海Invitrogen公司測序。

　　1.2.2 pA5-VP1在大腸桿菌BJ5183中與pAdeno VatorΔE1/E3的同源重組 取1 μL(約100 ng)純化的骨架載體pAdenoVatorΔE1/E3和5 μL(約1 μg)經PmeⅠ線性化的轉移質粒pA5-VP1在1個滅菌的離心管中混合;電轉化入感受態大腸桿菌BJ5183中(電轉化儀的參數設置為：2.5 kV，25 μF，200 Ω)，使其在大腸桿菌BJ5183中進行同源重組。獲得疑似重組腺病毒質粒用PacⅠ進行酶切鑒定，將陽性重組腺病毒質粒分別命名為pAd5-VP1。

　　1.2.3 重組腺病毒質粒轉染HEK-293A細胞 按堿裂解法大量提取質粒pAd5-VP1并經PEG沉淀法純化質粒DNA，經PacⅠ線性化，切除部分質粒構件，暴露出末端反轉重復序列。按照LipofectamineTM2000說明書轉染HEK-293A細胞，同時轉染pAdeno VatorΔE1/E3載體對照。由于pA5-CMV5-IRES-GFP系統在細胞內可以表達綠色熒光蛋白(GFP)，轉染后的12～24 h在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光來判斷目的基因是否表達，如果觀察到熒光，繼續培養7～10d，每天觀察熒光和細胞病變(CPE)。當出現明顯的細胞病變效應時，將細胞回收，-80℃凍存。

　　1.2.4 重組病毒的純化、鑒定及TCID50的測定 利用無限稀釋法進行純化。具體方法：在96孔細胞培養板上，每孔接種5×104個HEK-293A細胞，至80%密度時，在無血清培養液中感染病毒。重組病毒按連續10倍梯度稀至10-10，每個稀釋度接種8個孔，并設立空白對照。感染1～2h換成細胞培養維持液。通過觀察噬斑的形成過程，選取單噬斑孔細胞進行擴大培養。陽性重組腺病毒經PCR和Western-blot 鑒定。并測定重組病毒的TCID50。純化后的重組腺病毒在HEK-293A細胞上連續傳代10代，然后測TCID50，檢測重組病毒是否穩定。

　　2 結果

　　2.1 轉移載體pA5-VP1的構建教育類論文發表

　　2.1.1 目的基因的擴增 以pMD18-VP1為模板，用引物P1、P2擴增出大小約639 bp的條帶，結果如圖1。

　　1-3.VP1的PCR擴增結果;M.DL2000

　　圖1 VP1基因的PCR擴增

　　2.1.2 轉移載體的構建 在pA5-CMV5-IRES-GFP載體BglⅡ酶切位點的上游350 bp處有一個XhoⅠ位點，此位點也是載體上單一的酶切位點。在擴增目的基因的下游引物上設計一個XhoⅠ位點，將構建的轉移載體用XhoⅠ單酶切來鑒定目的基因是否插入載體中，并鑒定插入方向是否正確，如果目的基因正向插入載體中，酶切后可出現1kd左右的酶切片段，結果如圖2。

　　2.2 同源重組腺病毒質粒pAd5-VP1的線性化鑒定 在大腸桿菌BJ5183中篩選的重組病毒質粒，用PacⅠ單酶切，在0.7%的瓊脂糖凝膠電泳中出現兩條帶：分別為35 kb和4.5 kb，如圖3。將陽性重組病毒質粒分別命名為pAd5-VP1。

　　2.3 重組病毒的產生

　　2.3.1 重組病毒的熒光觀察 線性化重組病毒質粒pAd5-VP1轉染HEK-293A細胞，置37 ℃，5% CO2培養箱培養12h后觀察到熒光，說明質粒已在細胞中表達。繼續培養，7d后細胞逐漸開始變圓、脫落，10d以后出現較為明顯的細胞病變，見圖4(見封4)。反復凍融3次后，-20℃保存。

　　2.3.2 重組病毒的PCR檢測 提取重組病毒的基因組作為模板，同時以pAdenoVatorΔE1/E3作陰性對照;分別用引物P1、P2進行PCR擴增，重組病毒的基因組作為模板，PCR產物出現預期的條帶，而陰性對照沒出現條帶。結果如圖5。

　　2.3.3 重組病毒的Western-blot鑒定 Western-blot所用一抗為FMDV 的標準陽性血清，二抗為HRP-SPA，重組病毒能與FMDV 的標準陽性血清發生特異性反應，DAB顯色后出現特異性的條帶，而陰性對照沒有出現任何條帶。如圖6(見封4)。

　　2.3.4 重組病毒的純化及滴度測定 采用無限稀釋法對重組病毒進行純化，隨后測定純化病毒的TCID50，測得rAd5-VP1的滴度為1011.87TCID50/mL。

　　2.3.5 重組病毒的穩定性試驗 重組病毒在HEK-293A細胞上連續傳代10代后再測定TCID50，重組腺病毒效價穩定。
3 討論

　　目前制備重組腺病毒常用方法是細胞內質粒DNA同源重組法與細菌內同源重組法。細胞內同源重組涉及的步驟及環節較多、成功率較低、工作量大、實驗周期長。為了縮短實驗周期，提高效率，許多學者成功地采用特定的大腸桿菌來完成同源重組、重組病毒核酸的篩選和擴增過程，其中pAdEasy系統最具有代表性[7-8]。在此系統中，利用分子生物學技術構建2種特殊質粒：骨架質粒和穿梭質粒。骨架質粒帶有細菌ori和氨芐青霉素抗性編碼基因，含有腺病毒大部分基因組;穿梭質粒具有ori，卡那霉素抗性編碼基因，腺病毒的左臂和右臂同源區以介導在大腸桿菌內與骨架質粒上腺病毒基因組的同源重組。將目的基因克隆至穿梭質粒，然后將線性化的穿梭質粒和超螺旋的骨架質粒用電穿孔轉化具有修飾作用的特定的大腸桿菌BJ5183進行同源重組，所得重組腺病毒質粒可以通過卡那霉素抗性方便篩出，由于細菌內高效度的重組機制，可以在很短的時間內得到所需要的重組腺病毒，再用人工創建的PacⅠ位點酶切，即可用于轉染真核細胞。我們選用的pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP質粒中帶有GFP報告基因，可用于直接觀察轉染和感染效率及監測重組病毒的滴度，用鑒定正確的重組體腺病毒質粒轉染HEK-293A細胞，包裝產生的腺病毒可省卻細胞內同源重組法對包裝病毒必須進行的多輪費時、費力的篩選和鑒定。本研究中構建的表達FMDV 主要保護性抗原VP1重組腺病毒具有與口蹄疫陽性血清反應的能力，連續傳10代效價穩定且可穩定表達VP1基因，為后期的動物試驗奠定基礎。

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