TGF�拨�1、TGF�拨翿1、Smad4在乳腺癌發生、發展中的作用及其相互關系

【摘要】  　　目的：探討TGF�拨�1、TGF�拨翿1及Smad4三者在乳腺癌中的表達與其發生、發展、轉移等生物學行為以及預后的關系，為乳腺癌發病和治療機制提供理論和實驗依據。方法：提取30例乳腺癌臨床標本（經液氮、研磨等處理）和MCF��7、T47D、SKBR��3三種乳腺癌細胞（取指數增長期細胞）總RNA，反轉錄cDNA第一鏈，克隆TGF�拨翿1、Smad4基因片段，測定質粒濃度，制備標準樣品，并作出標準曲線，探針法熒光定量PCR（FQ�睵CR）檢測TGF�拨翿1和Smad4基因mRNA表達。結果：FQ�睵CR檢測發現惡性程度高的SKBR��3細胞，其TGF�拨翿1和Smad4的基因拷貝數明顯低于惡性程度低的MCF��7細胞（P均＜0.01），T47細胞兩種基因拷貝數介于兩者之間。結論：隨著乳腺癌細胞病理類型惡性程度增加，TGF�拨翿1和Smad4 mRNA表達逐步下降，表明TGF�拨�1和Smad4可能具有類似乳腺癌抑癌基因的作用。

【關鍵詞】  轉化生長因子β1; 轉化生長因子β1受體; Smad4; 乳腺癌

　　［ABSTRACT］ Objective: To investigate the expression of TGF�拨�1, TGF�拨翿1 and Amad4 proteins and the relationship to the initiation, progression, metaptosis and prognosis of breast cancer. Methods: The samples of 30 cases and 3 cell lines(MCF��7,T47D,SKBR��3) of breast cancer were selected, and the total mRNA was extracted. Reverse transcription, and TGF�拨翿1 and Smad4 genes cloning were carried out. Then the concentration of plasmid was measured, standard curve was made, and the expression of TGF�拨翿1 and Smad4 mRNAs were assayed by FQ�睵CR machine. Results: The gene copies of TGF�拨翿1 and Smad4 in SKBR��3 cells were lower than that in MCF��7 cells (P＜0.01) and the gene copies in T47 was middle. Conclusions: Our studies by FQ�睵CR show that the lower TGF�拨翿1 and Smad4 mRNAs expression, the worse biology characteristic of breast cancer, which indicate TGF�拨翿1 and Smad4 act possibly as the role of anti�瞣ncogene in breast cancer.
   
　　［KEY WORDS］ TGF�拨�1; TGF�拨翿1; Smad4; Breast cancer

　　乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，全世界每年約有120萬婦女患乳腺癌。目前，乳腺癌病因尚不十分清楚，發病機理非常復雜，涉及多個因素的作用。多數研究認為，乳腺癌的發生是因為原癌基因的激活和抑癌基因的功能喪失，其發展是一個多因素多階段的過程，往往涉及多個基因的改變［1,2］。TGF�� β /Smads信號傳導通路及其與腫瘤關系多見于胰腺癌、婦科腫瘤等［3,4］，而在乳腺癌中TGF�拨�1、TGF�拨翿1及Smad4三者的表達及其相互關系如何，它們對乳腺癌發生、發展有何意義，目前還不完全清楚。本實驗擬采用熒光定量PCR (fluorescent quantitation polymerase chain reaction，FQ�睵CR)、免疫組織化學/免疫細胞化學、Western Blotting等技術，檢測乳腺癌患者和乳腺癌細胞株中的TGF�拨�1、TGF�拨翿1和Smad4 在mRNA水平和蛋白水平表達，進一步深入三者在乳腺癌中的表達與其發生、發展、轉移等生物學行為以及預后的關系，為探討TGF�拨滦盘栟D導過程提供新的思路，同時為乳腺癌的Smad4基因導入治療，以及嘗試應用iRNA技術，提供理論和實驗依據

　　1  材料與方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  標本和細胞 發表醫學論文

　　本組乳腺癌臨床標本共30例，全部為海南醫學院附屬醫院2005年1月～2008年12月門診或住院患者，其中外科手術切除標本25例，病理活檢標本5例。患者年齡24～60歲，中位年齡43歲；按照病理學類型分為非浸潤性癌4例、早期浸潤性癌6及浸潤性癌20例。
   
　　乳腺癌細胞株MCF��7、T47D、SKBR��3細胞為本實驗室保存。正常對照：選取非乳腺癌患者正常乳腺組織手術切除標本10例作為對照。

　　1.1.2  質粒和細菌

　　pGEM�睺�睺GFβR1 、pGEM�睺�睸mad4質粒構建按照pGEM�睺 載體試劑盒（公司）的說明。大腸桿菌DH5α為本實驗室保存。

　　1.1.3  引物和探針

　　以Genebank中Smad4 和TGF�拨翿1基因 的mRNA序列作參考，各設計一對引物和一條探針。⑴Smad4  上游引物(P1)：5′�睪TCGAAAACAACGCTATTGACT��3′； 下游引物(P2)：5′�睠AGAGAATTGTCGCCGTACAT��3′； 熒光探針：5′�睺CAGGACGCGATACCTCGGTATACC��3′。 ⑵TGF�拨翿1上游引物(P1)：5′�睪AACGACAACGATTCAACT��3′； 下游引物（P2）：5′�睪CAACACGATCATGACTT��3′； 熒光探針為5′�睺CTACGTAATAGCATGCGCCAAAT��3′。
   
　　探針5′端標記的熒光報告基團均為FAM，3′端標記的熒光淬滅基團均為TAMRA。引物及探針均由英俊公司合成。

　　1.1.4  主要試劑

　　RPMI��1640培養基（GIBCO BRL公司）；無支原體胎牛血清（杭州四季青公司）；HEPES粉（ASBC進口分裝）；PBS緩沖液（NaCl 8.0g, Na2HPO4·12H2O 3.63g, KH2PO4 0.2g, pH7.4，自配）；胰蛋白酶（Sigma公司）；EDTA（公司）；TRIzol Reagent（Invitrogen公司）；DEPC（威佳公司）；氯仿（國產）；異丙醇（國產）；RT試劑盒（Fermentas公司）；Taq 酶（Progema公司）；DNA Marker（威佳公司）；Gel Estration Kit和小量質粒抽提試劑盒（QIAGEN公司）；PCR產物純化試劑盒（博彩生物公司）。

　　1.1.5  儀器

　　二氧化碳孵箱（Hereaus B5060EK/CO2）； 倒置相差生物顯微鏡（Olympus公司）； 紫外/可見光分光光度計（Beckman DU530）； 熒光定量PCR 儀（ABI公司）； 數顯調速多用振蕩器（江蘇金壇榮華儀器制造有限公司）； 臺