AS�睵CR方法檢測中國人群CYP2C19基因多態性

【摘要】  目的：建立一種快速、靈敏的細胞色素氧化酶P450 2C19基因多態性檢測方法。方法：分離外周血淋巴細胞基因組DNA，分別用一對等位基因特異性(allele�瞫pecific, AS)的反向引物與共用正向引物進行PCR擴增，通過電泳分析對應的PCR產物來判斷CYP2C19基因型。在AS引物3′端倒數第三位或第二位引入錯配堿基改進特異性。采用優化后方法對278例健康人進行CYP2C19基因型分析。結果：AS�睵CR可檢測CYP2C19基因多態性，引入第二個錯配堿基可提高檢測特異性。經直接測序驗證結果完全一致。結論：建立和優化的AS�睵CR方法適用于CYP2C19基因多態性快速檢測。

【關鍵詞】  細胞色素氧化酶2C19；遺傳多態性；基因型；等位基因特異性PCR
  

［ABSTRACT］ Objective: To develop a rapid and sensitive method for genotype analysis of the CYP2C19 gene in Chinese population. Methods: The genomic DNA was extracted from lymphocytes. A common forward primer and one of the two allele�瞫pecific (AS) reverse primers were used in parallel PCR reactions. The PCR products were analyzed by electrophoresis and specific amplification indicated the presence of the allele. In order to enhance the PCR specificity, the extra mismatch based at the third or second nucleotide position from the 3′�瞖nd of AS primers were introduced. Results: Two hundred and seventy�瞖ight DNA samples were analyzed by this new method. The CYP2C19 genotyping results derived from this ASA�睵CR were perfectly consistent with sequencing. Conclusion: The new method developed and optimized in this study is a suitable strategy for CYP2C19 genotyping. It also enables accurate and rapid detection of CYP2C19 polymorphisms.
   
［KEY WORDS］ CYP2C19; Genetic polymorphism; Genotype; Allele�瞫pecific PCR

    細胞色素氧化酶P450 2C19 (CYP2C19)是人體中重要的代謝酶。最初因催化S�裁婪彝子⒘u化代謝功能而被稱為S�裁婪彝子⒘u化酶［1］, CYP2C19催化羥化、氧化及環化等反應，參與機體多種內源性及外源性化學物質的代謝。奧美拉唑、美芬妥英、安定、普萘洛爾等臨床常用藥物經CYP2C19代謝［2-4］，CYP2C19的功能與疾病風險及藥物療效都密切相關。

   
CYP2C19活性存在個體間差異，以S�裁婪彝子�為探針藥物，依據其代謝速度分為強代謝表型（Extensive Metabolism，EM）和弱代謝表型（Poor Metabolism，PM）。研究發現個體間代謝表型差異的重要原因是其基因多態性，外顯子5上的第681位密碼子G>A變異（c681G>A，稱為“m1突變”）和外顯子4上的第636位密碼子G>A變異（c636G>A，稱為“m2突變”）是引起PM表型的最主要基因變異。亞洲人群95%以上PM表型由m1和m2變異決定［5，6］。

   
分析CYP2C19基因多態性可推斷代謝表型，從而預測解毒能力和患病風險，還可預測藥物代謝能力、藥物療效及毒副作用，指導臨床合理用藥。本研究基于等位基因特異性PCR（allele�瞫pecific PCR，AS�睵CR）原理，建立了快速CYP2C19基因多態性檢測方法，探索提高檢測特異性的條件。并用所建立方法對健康人群CYP2C19基因多態性等位基因分布頻率進行了初步分析。

1  材料與方法

1.1  基因組DNA提取

   
278例健康體檢者，男性155例，女性123例，平均年齡41歲。新鮮采集外周靜脈血，EDTA抗凝保存。采用基因組DNA提取試劑盒（天根生物技術公司），參照使用說明書操作，提取基因組DNA，-80℃保存備用。

1.2  引物設計

   
參照Genbank中CYP2C19基因序列（AY796203）和AS�睵CR原理［7］，采用OLIGO 6.0軟件設計引物（圖1）：針對每個變異位點設計一對等位基因特異性引物（AS引物），其3′末端分別與變異位點G或A堿基互補。M1AS�睷P1�睺和M1AS�睷P1�睠用于檢測m1變異（c681G>A）；M2AS�睷P1�睺和M2AS�睷P1�睠用于檢測m2變異（c636G>A）。為增加擴增特異性和檢測分辨率，設計在3’端第3位(M1AS�睷P2�睺和M1AS�睷P2�睠)或第2位（M2AS�睷P2�睺和M2AS�睷P2�睠）引入錯配堿基的AS�睵CR引物（表1）。同時為排除PCR反應系統敏感性所致基因型判斷失誤，在AS引物下游設計了參照引物M1Ref�睷P和M2Ref�睷P。上游共用引物與一種AS引物用作突變檢測，含對應等位基因的模板中可擴增PCR產物，而不含對應等位基因的模板則不擴增。在所有標本中參照引物與正向引物共同擴增較大的片段，作為PCR的系統內參照。檢測c636G>A的AS�睵CR產物為146bp，參照PCR產物為439bp；檢測c681G>A的AS�睵CR產物為143bp，參照PCR產物為309bp。

圖1  引物設計示意圖

表1  AS�睵CR引物序列

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命名序列注釋

M1AS�睩P5′�睞CAACCAGAGCTTGGCATATTGT��3′
M1AS�睷P1�睺5′�睪GTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTCCT��3′
M1AS�睷P2�睺5′�睪GTTTTTAAGTAATTTGTTATGGGTTGCT��3′3′第三位錯配
M1AS�睷P1�睠5′�睺TTTTA AGTAATTTGTTATGGGTTCCC��3′
M1AS�睷P2�睠5′�睺TTTTA AGTAATTTGTTATGGGTTGCC��3′3′第三位錯配
M1Ref�睷P5′�睠AATGAATCACAAATACGCAAGC��3′
M2AS