低強度間斷負壓誘導人骨髓間充質干細胞向成骨細胞的分化

【摘要】  　　目的 利用低強度間斷負壓誘導人骨髓間充質干細胞(MSCs)向成骨細胞定向分化。方法 分離人骨髓，利用梯度離心法進行MSCs的培養，取第三代細胞利用低強度間斷負壓誘導分化；倒置顯微鏡下觀察細胞的形態，檢測堿性磷酸酶(ALP)活性，茜素紅染色觀察鈣結節形成，免疫組織化學檢測Ⅰ型膠原和骨保護素的表達。結果 低強度間斷負壓誘導2周后，細胞呈現出成骨細胞形態，ALP活性明顯增強，茜素紅染色可見鈣結節形成，Ⅰ型膠原和骨保護素表達陽性。結論 利用低強度間斷負壓可以成功的誘導MSCs向成骨細胞定向分化，誘導的細胞具有典型的成骨細胞特性。

【關鍵詞】  負壓 骨髓間充質干細胞 成骨細胞 誘導

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the effect of low-intensity interrupted negative pressure on the differentiation of human marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into osteoblast in vitro. Methods  MSCs were isolated from adult marrow using density gradient separation method, passage 3 cells were chosen to induce differentiation; the differentiation of MSCs was examined by phase-contrast microscopy, the determination of alkaline phosphatase (ALP) activities, alizarin-red staining and the immunohistochemistry of typeⅠcollagen and osteoprotegerin. Results  MSCs showed a typical appearance of osteoblasts after 2 weeks�� induction by low-intensity interrupted negative pressure, the activities of ALP were increased significantly, calcium nodes were seen by alizarin-red staining, the expressions of collagen typeⅠ and osteoprotegerin were positive. Conclusion  Low-intensity interrupted negative pressure could successfully induce human MSCs into osteoblasts and the induced cells show characteristics of osteoblasts.

　　KEY WORDS: negative pressure; marrow mesenchymal stem cell; osteoblast; induction

　　近年來，負壓封閉引流技術(vacaum assisted closure, VAC)在外科創面處理方面取得了巨大的成功，該項技術能改善創面血供促進創面愈合［1］。負壓技術對骨組織有何作用以及作用的機制如何，能否用來促進骨折愈合、治療骨壞死等方面，國內外尚無學者對其進行研究。本研究在預實驗的基礎上通過觀察低強度間斷負壓對人骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)誘導分化的影響，以闡述其作用機制，為今后在骨折愈合和骨壞死方面的研究提供理論依據。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料 教師論文發表

　　骨髓2例取自我科診斷為髖關節骨性關節炎，行人工關節置換的手術患者，年齡分別為56歲和61歲。兩例患者肝腎功能正常，無代謝性骨病及傳染病，手術前經患者同意，術中截骨后經骨髓腔抽取骨髓5mL，吸入預先加有肝素的針筒備用。

　　1.2  主要試劑與儀器

　　L-DMEM培養基、胰蛋白酶均為Gibco產品，Percoll分離液為Sigma產品(1.073 g/mL)，胎牛血清(杭州四季青)，Ⅰ型膠原和骨保護素免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，完全培養基的組成：L-DMEM培養基加入100 mL/L胎牛血清，青、鏈霉素終濃度為100 u/mL，微型負壓儀。

　　1.3  細胞原代培養

　　細胞采用梯度離心法進行培養：將抽取的骨髓分裝入離心管，加入 L-DMEM培養基2 mL，1 500 r/min離心5 min去除上層脂肪滴和上清，以D-Hank�餾液重懸細胞后平鋪于Percoll分離液上，1 500 r/min離心10 min，吸取中間層的白膜層(單核細胞層)，以D-Hank�餾液洗滌，加入L-DMEM培養基置入無菌培養瓶中，37 ℃、5%(體積分數)的CO2孵育箱培養。

　　1.4  負壓誘導  高級職稱論文發表
　　
　　取第三代細胞進行負壓誘導，把24孔和6孔培養板中培養液預先吸掉4/5，打開蓋置入自行設計的無菌密閉容器中，容器側面有孔和導管與微型負壓儀相連，打開負壓儀設置壓力為20 kPa，30 min/次，2次/d。每次誘導完畢后取出培養板補足培養液，實驗分為負壓誘導組和正常培養組。

　　1.5  細胞觀察

　　倒置顯微鏡下每日觀察細胞的生長情況和形態特點，拍照記錄。

　　1.6  堿性磷酸酶活性的測定

　　誘導2周后，兩組細胞用考馬斯亮蘭微板法測定每孔中細胞蛋白含量，采用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)試劑盒測定細胞ALP活性，定量測定兩組細胞中平均每毫克蛋白質的ALP活性變化，比較兩組的差異。

　　1.7  茜素紅染色

　　誘導2周后，倒掉培養液，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3遍，茜素紅染色8 h，顯微鏡下觀察陽性結果。

　　1.8  免疫組織化學檢測Ⅰ型膠原和骨保護素的表達 
　　誘導2周后，細胞用40 g/L多聚甲醛固定20 min，進行Ⅰ型膠原和骨保護素免疫組織化學檢測，一抗為鼠抗人Ⅰ型膠原和骨保護素單克隆抗體，DAB顯色。

　　1.9  統計學處理

　　應用SPSS11.0統計軟件進行數據分析，結果用均數±標準差( ±s)表示，以t檢驗進行數據分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2  結 果

　　2.1  倒置相差顯微鏡所見的細胞形態的變化

　　用間斷負壓誘導的細胞增殖速度略低于正常培養組細胞，細胞形態逐漸由梭型向多角型轉化，帶有數個突起，數目和形態不定，10-14 d細胞融合成單層，2周后逐漸形成多個散在的致密島狀結構，而正常培養組細胞的形態大部分為梭型。誘導成功后，細胞1周左右傳1代，可穩定傳10代。

　　2.2  ALP活性的測定

　　誘導2周后，間斷負壓誘導組的細胞ALP活性為(15.68±1.97)u/g，正常培養組為(6.34±1.21)u/g，t檢驗兩組差異有統計學意義(P<0.05)。

　　2.3  茜素紅染色和Ⅰ型膠原及骨保護素的免疫組織化學檢測

　　負壓誘導2周后，茜素紅染色可見多個散在分布大小形態各