槐定堿預(yù)防小鼠內(nèi)毒素性肝損傷的作用及對肝臟CD14、TLR4表達的影響

【摘要】  目的 研究預(yù)防性給予槐定堿對小鼠內(nèi)毒素血癥急性肝損傷的影響及對CD14、TLR4表達的調(diào)節(jié)。方法 觀察槐定堿12、6、4mg/kg三個劑量預(yù)防性處理的小鼠，在給予內(nèi)毒素后2、6、12、24h時各組小鼠一般狀況、肉眼及光鏡下肝組織的病理變化，賴氏法測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)濃度，RT-PCR與Western Blot分別檢測肝組織CD14及 TLR4 的 mRNA 與蛋白表達，放免法檢測血清TNF-α含量的變化。結(jié)果 槐定堿三個劑量預(yù)防性給予，各個時間點結(jié)果均表明改善了內(nèi)毒素血癥模型小鼠的一般狀況，減輕了肝組織病理改變；槐定堿三個劑量組的ALT值均低于同時間點的LPS模型組（P＜0.01或P＜0.05）；槐定堿三個劑量組與同時間點LPS模型組比較，均下調(diào)肝組織CD14 、TLR4 mRNA和蛋白的表達（P＜0.01或P＜0.05）；槐定堿三個劑量組血清TNF-α水平均較同時間點LPS模型組降低（P＜0.01或P＜0.05），并在24h時均降至正常對照組水平。結(jié)論 槐定堿12、6、4mg/kg三個劑量預(yù)防性給予，可抑制內(nèi)毒素血癥小鼠肝臟炎癥反應(yīng)，其機制可能與下調(diào)LPS識別受體CD14、TLR4表達，并進而抑制下游炎癥因子分泌有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】  苦豆子；槐定堿；內(nèi)毒素；肝臟；CD14；Toll樣受體4圖書館論文發(fā)表

　　Abstract: Objective  To observe the preventive effect of Sophoridine on liver inflammatory reaction of mice with endotoxemia，and its effect on the expression of CD14 and TLR4.Methods  The ICR mice were administered by three dosage of  Sophoridine, that was high doses (12mg/kg), middle doses（6mg/kg）and  low  doses（4mg/kg）. 2，6，12，24 hours after LPS injection, general symptoms were recorded,the blood and liver samples were taken and pathological damages of liver were checked. The level of alanine aminotransaminase(ALT) in serum  was measured by Reitman mensurate rating. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT�睵CR) was employed to detect the mRNA expression of CD14 and TLR4 in liver. Protein expression of CD14 and TLR4 in liver were assessed by Western Blot. Serum TNF�拨� levels were determined by radio immunoassay. Results  The results of three dosage of Sophoridine pretreated groups at each time�瞤oint  showed that Sophoridine could ameliorate the general symptoms of endotoxic liver injury models significantly and decrease pathological damage of liver tissue. The three Sophoridine group with different doses showd a significantly lower ALT value than that in the LPS model at the same time point（P＜0.01 or P＜0.05）； compare to the LPS model, the express of CD14 , TLR4 mRNA and proteins in the liver of the three different doses sophoridine group  were down�瞨egulated significantly（P＜0.01 or P＜0.05）, and the levels of serum TNF�拨� of three Sophoridine group were significantly reduced than those in the LPS model at the same time point（P＜0.01 or P＜0.05）, and they reached the level of normal control groups at 24h.Conclusion  The mechanism of Sophoridine anti�瞖ndotoxin liver injury had a strong relation with down�瞨egulating of the expression of CD14 and TLR4, and influence of TLR4 transduction pathway, and restraining secretion of downstream inflammatory factors.

　　Key words: sophora alopecuroides L; sophoridine; endotoxin; liver; CD14；toll like receptor

　　細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），即內(nèi)毒素（endotoxin，ET），是革蘭陰性菌（G-菌）的主要病原相關(guān)分子模式。G-菌感染引起膿毒癥，并進一步導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征，內(nèi)毒素是主要病原因素之一。因為抗內(nèi)毒素藥物缺如，內(nèi)毒素所致疾病一直是臨床治療的棘手難題［1-3］。近年來，Toll樣受體4（TLR4）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的發(fā)現(xiàn)為人們攻克內(nèi)毒素所致疾病提供了新的方向，將該轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的信號受體作為靶位, 以阻斷炎癥的級聯(lián)反應(yīng),從而防止失控性炎癥發(fā)生，已成為開發(fā)新的抗內(nèi)毒素藥物的途徑之一。苦豆子(Sophora alopecuroides L)為豆科槐屬植物，槐定堿是苦豆子中含量較高的生物堿之一。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，槐定堿對內(nèi)毒素肺損傷小鼠模型具有顯著的保護效應(yīng)［4］，有必要對其進行更為深入的研究。肝臟是機體清除內(nèi)毒素的主要器官，同時也是內(nèi)毒素血癥時受損最早、最明顯的靶器官之一［5］。本研究通過建立小鼠內(nèi)毒素血癥急性肝損傷模型，觀察預(yù)防性給予槐定堿對小鼠內(nèi)毒素性肝損傷的作用，探討其作用是否與調(diào)節(jié)LPS 識別受體CD14、TLR4表達有關(guān)。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  主要試劑和儀器

　　LPS(E.coli 055∶B5), Sigma公司產(chǎn)品;槐定堿(批號:960324 ，mp 109℃，含量98%以上)購于寧夏藥物研究所; 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒購于北京北化康泰臨床試劑有限公司；RT-PCR試劑盒購于美國Promega公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗小鼠TLR4、 CD14多克隆抗體購于美國Santa Cruz 公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購于北京中杉金橋生物有限公司；小鼠TNF-α放免分析試劑盒購于北京科美東雅生物技術(shù)有限公司。

　　1.1.2  動物

　　ICR小鼠,清潔級,均為雄性,6～8周齡,18～22 g,寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,動物許可證號：SCXK(寧)2005-0001。

　　1.2  方法

　　1.2.1  藥物

　　參照小鼠腹腔注射槐定堿的LD50（58.0 mg/kg）［6］，實驗選用槐定堿約1/5、1/10、1/15 LD50三個劑量。

　　1.2.2  動物模型制備與分組

　　ICR小鼠腹腔注射LPS(E.coli 055：B5)10 mg/kg(經(jīng)預(yù)試驗選定)制備小鼠內(nèi)毒素血癥急性肝損傷模型。

    實驗小鼠隨機分為5組，每組20只，即①正常對照組；②內(nèi)毒素肝損傷模型組；③④⑤組分別為槐定堿高劑量（12mg/kg ）、中劑量 （6mg/kg ）、低劑量 （4mg/kg ）組。①②組小鼠腹腔注射0.2mL/10g生理鹽水，③④⑤組小鼠每天分別腹腔注射槐定堿高、中、低劑量，連續(xù)3d；然后，除①組末次注射后30min腹腔注射生理鹽水0.2mL外，②③④⑤組均在末次注射后30min腹腔注射LPS 10mg/kg； 隨后各組分別在注射LPS后2 、6 、12 、24h四個時間點隨機抽取5只小鼠，進行觀察檢測。

　　1.2.3  觀察指標(biāo) 圖書館論文發(fā)表

　　各組小鼠分別在給予 LPS后相應(yīng)時間點記錄一般狀況并取材，①賴氏法測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)濃度：摘小鼠眼球取血置小試管中，血液凝固后，3000r/min離心10min，吸取血清，按ALT檢測試劑盒說明書進行操作；②肝臟的病理變化：肉眼觀察肝臟形態(tài)、色澤、包膜等的改變；取各肝右葉同一部位，置10%中性福爾馬林磷酸鹽緩沖液固定后,石蠟包埋,HE染色,光鏡觀察肝組織的病理變化；③ RT-PCR檢測肝組織CD14和TLR4 mRNA表達水平：PCR引物由北京賽百盛公司合成。

    TLR4引物：5'GCAATGTCTCTGGCAGGTGTA 3'，
5'CAAGGGATAAGAACGCTGAGA 3',片段長度為406bp;
    CDl4引物：5'TTGCGGAGGTTCAAG ATG 3'，
5'TGTGGACACGGAAGCAGA 3',片段長度為237bp;
    β-actin引物：5'TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC3'，5'TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG3',片段長度為350bp。
   
　　提取小鼠肝組織總 RNΑ，采用Promega公司的一步法 RT-PCR 試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作；PCR產(chǎn)物電泳凝膠置于凝膠圖像分析系統(tǒng)成像，以 Bio-Image Analysis System 進行半定量分析，結(jié)果以相對光密度值 (relative optical density, ROD)×面積(mm2)表示；④Western-Blot檢測肝組織CD14和TLR4蛋白表達水平：提取標(biāo)本的總蛋白；測定樣品蛋白濃度（BCA法）；行SDS-PAGE后，用凝膠圖像分析成像系統(tǒng)進行掃描分析，以目的條帶面積灰度值/內(nèi)參（β-actin）條帶面積灰度值做為半定量檢測結(jié)果；⑤放射免疫分析法檢測血清腫瘤壞死因子（TNF-α）含量：取血清，按試劑盒說明書操作，γ放免計數(shù)儀檢測，打印出數(shù)值。

　　1.3  統(tǒng)計學(xué)方法

    實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析進行組間差異表示。應(yīng)用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，多樣本均數(shù)間比較采用One-Way ANOVA檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2  結(jié)果

　　2.1  小鼠一般狀況的改變

    正常對照組小鼠在各時間點均活動自如，進食正常，無病態(tài)；槐定堿各劑量組小鼠于末次給藥后30min，注射LPS， 2h 時各劑量組小鼠均見活動減少；6h時蜷縮無力，進食減少，低劑量組有口唇發(fā)紫，個別有腹瀉癥狀，但高、中劑量組未見口唇發(fā)紫及腹瀉；12h時各劑量組前述癥狀緩解；24h時各劑量組小鼠進食、活動基本恢復(fù)正常。各時間點的一般狀況均明顯好于同時間點LPS模型組。各實驗組小鼠均無死亡。

　　2.2  小鼠肝臟的病理學(xué)觀察

　　2.2.1  大體觀察

　　正常對照組小鼠肝臟形態(tài)正常，色澤紅潤，包膜光滑，質(zhì)地柔軟。槐定堿各劑量處理小鼠給予LPS后2h 及6h肝臟無明顯肉眼可見變化；12h時各劑量組小鼠肝臟均有輕微腫脹；24h時肝臟腫脹較明顯，其中低劑量組的部分小鼠肝臟表面可見點狀及片狀出血點。但與LPS模型組12h及24h時間點相比，槐定堿各劑量組小鼠肝臟充血水腫程度較輕，中、高劑量組未見肝表面有出血點。

    光鏡觀察：正常對照組各時間點肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，未見炎性細胞。LPS模型組2h時無明顯變化；6h時肝小葉內(nèi)血管擴張充血，肝細胞輕微腫脹、有散在炎性細胞浸潤；12h時除上述病變更為明顯外，部分區(qū)域有散在點狀及小灶狀壞死，部分肝細胞出現(xiàn)雙核現(xiàn)象；24h時可見小葉內(nèi)肝竇擴張充血，肝細胞氣球樣變，壞死部位見較多淋巴細胞及中性粒細胞浸潤，匯管區(qū)可見血管擴張充血及炎細胞浸潤。槐定堿各劑量組較同時間點LPS組病變明顯減輕，24h時病變減輕尤為明顯。槐定堿高、中劑量組病變輕于低劑量組。參見圖1(見封3)。

　　2.3  小鼠血清中ALT含量測定
     
　　槐定堿三個劑量組的ALT值在2、6h時間點變化曲線與LPS模型組相仿，但均低于同時間點的LPS模型組（P＜0.01或P＜0.05），12h時，LPS模型組的ALT值升至頂峰，而槐定堿三個劑量組則趨于下降，至24h時除低劑量組外均已達到正常水平。圖書館論文發(fā)表
   
　　槐定堿高、中劑量組在2、6、24h時間點的降A(chǔ)LT效應(yīng)明顯強于低劑量組（均P＜0.05），說明槐定堿降低小鼠血清ALT作用具有一定的量-效關(guān)系，高、中劑量組優(yōu)于低劑量組,見圖2。

　　2.4  小鼠肝組織中CD14 與 TLR4 的mRNA表達

　　2.4.1  肝組織中CD14 mRNA表達

    槐定堿高劑量組在給予 LPS后各時間點肝組織 CD14mRNA表達水平均低于LPS模型組（P均＜0.01），而與正常對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；中劑量組各時間點CD14mRNA表達水平亦均顯著低于LPS模型組（P均＜0.01），僅6h時間點CD14mRNA表達明顯高于正常對照組；而低劑量組在2、12、24h時間點CD14mRNA表達水平雖均低于LPS模型組（P＜0.05或 P＜0.01），但從2h 起，至12h時均仍明顯高于正常對照組（P＜0.05或 P＜0.01），24h時才接近正常對照組水平，見圖3、4。

　　2.4.2  肝組織中TLR4 mRNA表達
      
　　模型組小鼠給予 LPS后2h肝組織 TLR4 mRNA表達開始上調(diào)，并迅速于 6h 達高峰，以后開始下降（P＜0.01），至 24h 時接近正常對照組水平。槐定堿三個劑量組在給予LPS后TLR4 mRNA表達趨勢與LPS模型組相似, 但與同時間點LPS模型組比較，槐定堿三個劑量均表現(xiàn)出下調(diào)TLR4 mRNA作用，至12h 除低劑量組外，高、中劑量組已接近正常對照組水平，見圖5、6。

　　2.5  小鼠肝組織中CD14、 TLR4的蛋白表達

　　2.5.1  肝組織中CD14蛋白表達
      
　　模型組在給予 LPS后各時間點CD14蛋白表達趨勢與其mRNA表達基本一致。2h肝組織中 CD14蛋白表達開始明顯上調(diào)，并迅速于 6h 達高峰，以后開始下降，至 24h 仍明顯高于正常對照組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。槐定堿高、中、低劑量組在給予LPS后CD14蛋白表達趨勢與LPS模型組相似，但除6h低劑量組外各時間點的CD14蛋白表達均顯著低于同時間點LPS模型組（P＜0.01或P＜0.05），見圖7、8。

2.5.2  肝組織中 TLR4 蛋白表達

    LPS模型組小鼠各時間點TLR4蛋白表達趨勢與其mRNA表達基本一致。2h肝組織 TLR4蛋白表達開始上調(diào)，于 6h 達高峰（P＜0.01），以后開始下降（P＜0.05），24h 時已接近正常對照組水平。槐定堿高、中、低劑量組在給予LPS后2 h 的TLR4蛋白表達均與正常對照組無統(tǒng)計學(xué)意義，至6h三個劑量組的TLR4蛋白表達均達高峰，但在12h時均已較LPS模型組提前下調(diào)至接近正常對照組水平，見圖9、10。
　　　
　　2.6  血清中TNF-α含量

    槐定堿三個劑量處理小鼠給予LPS后血清TNF-α水平均較同時間點LPS模型組顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），并在24h時均降至正常對照組水平。槐定堿三個劑量組之間下調(diào)血清TNF-α的效應(yīng)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖11。

　　3  討論圖書館論文發(fā)表

    本研究用槐定堿高（12mg/kg）、中（6mg/kg）、低（4mg/kg）三個劑量預(yù)防性給予急性內(nèi)毒素血癥肝損傷模型小鼠，動態(tài)觀察各個時間點結(jié)果，均表明顯著改善了模型小鼠的一般狀況，減輕了肝組織病理損傷，顯著降低血清ALT含量，其作用還呈現(xiàn)出一定的量-效關(guān)系。說明槐定堿具有阻斷內(nèi)毒素性肝臟炎癥反應(yīng)，減輕組織損傷的作用。

    CD14、TLR4是細胞膜表面的LPS識別受體，LPS結(jié)合脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)與mCD14后, 需借助跨膜的TLR4向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)LPS信號。內(nèi)毒素所致膿毒癥主要是由于TLR4轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游炎癥因子的失控性釋放，引起組織損傷和器官功能紊亂所致。因此目前認為CD14、TLR4是內(nèi)毒素所致炎癥反應(yīng)發(fā)生的起步點，在炎癥級聯(lián)反應(yīng)中具有類似于“閥門”樣的作用［7-8］。調(diào)節(jié)內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最上游的關(guān)鍵分子，影響細胞對LPS的識別，使機體對LPS的炎癥反應(yīng)不至過強，可能成為有效防治膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要方法。本研究結(jié)果表明槐定堿可下調(diào)肝組織CD14及TLR4的mRNA和蛋白表達，因而可減少LPS與CD14、TLR4的結(jié)合，抑制下游炎癥因子表達，減輕內(nèi)毒素的損傷效應(yīng)。

    TNF-α是公認的致炎細胞因子。已有報道膿毒癥大鼠肝臟組織TLR4mRNA及TNF-αmRNA的表達呈顯著正相關(guān)［9］,也就是說，TLR4 mRNA的表達增高,下游炎癥因子TNF-α合成、分泌即增多，反之亦然。內(nèi)毒素通過激活肝臟Kupffer細胞（KCs）釋放大量TNF-α等炎性細胞因子，不但直接損害肝細胞，還使肝臟清除內(nèi)毒素能力下降而加重內(nèi)毒素血癥，再促進TNF-α產(chǎn)生。TNF-α大量分泌再加重肝細胞損傷，并成為引起后續(xù)多器官損傷的重要環(huán)節(jié)。故本研究中選擇檢測血清中TNF-α作為指示槐定堿調(diào)節(jié)CD14、TLR4表達，影響下游炎癥因子表達的指標(biāo)。本研究中槐定堿三個劑量預(yù)防性給予模型小鼠在各個時間點都顯著降低血清TNF-α水平（P＜0.01或P＜0.05），并在24h時均已達到正常對照組水平。此結(jié)果表明槐定堿下調(diào)肝組織CD14和TLR4表達與下調(diào)血清TNF-α含量的一致性，再結(jié)合上述槐定堿阻斷內(nèi)毒素性肝臟炎癥反應(yīng)，對內(nèi)毒素血癥小鼠的保護作用，說明槐定堿減輕內(nèi)毒素性肝損傷的作用機制與其調(diào)節(jié)細胞表面LPS的模式識別受體CD14和TLR4的表達，并進而影響LPS的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制下游炎癥因子表達有關(guān)。

    當(dāng)然除CD14和TLR4外，在LPS炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上還有其它上游和下游受體及轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，各自都有固定的功能，槐定堿對它們的作用還有待于深入研究。

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