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曲安奈德抑制BN大鼠脈絡膜新生血管生長

作者:時間:2011-03-04 13:42:39 來源:www.6scc.cn 閱讀次數:901次 ]

【摘要】目的：觀察光凝后即刻玻璃體腔內注射曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)對BN大鼠脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)生長的抑制作用機制。方法：健康BN大鼠36只隨機分為兩組，隨機抽取一眼作為實驗眼。建立BN大鼠CNV動物模型。光凝后的即刻行玻璃體腔內注射TA 8μL(320μg)，對照組則在光凝眼行玻璃體腔內注射BSS 8μL。分別在光凝后1，2，4wk各處死動物6只，摘除眼球，制作石蠟切片，利用光鏡觀察不同時間點的CNV的變化。利用免疫組化的方法對NFκB，MCP1和FⅧRAg蛋白的表達進行半定量檢測，并用原位雜交法檢測VEGF的基因表達，并行半定量檢測。結果：實驗1，2，4wk，與對照組相比NFκB，MCP1和FⅧRAg蛋白表達及VEGF的基因表達明顯降低(P<0.05)。結論：TA能夠降低NFκB，MCP1等的表達和VEGF的轉錄，故TA是治療CNV的一種有效的藥物。

【關鍵詞】曲安奈德;脈絡膜新生血管;核因子κB;單核細胞趨化蛋白1;血管內皮生長因子;Ⅷ因子相關抗原;積分光密度教育論文發表網

　　　AbstractAIM: To observe the inhibition of krypton induced choroidal neovascularization (CNV) of brown norway (BN) rat by intravitreal triamcinolone acetonide(TA) injection after photocoagulation, and to study the mechanism of inhibition of CNV growth.METHODS: Thirtysix healthy BN rats were divided randomly to two groups, one eye was chosen randomly as experimental eye. After establishing BN rat CNV model, 8μL(320μg) TA was injected in vitreous immediately after photocoagulation in treatment group, the same volume isotonic balanced salt solution (BSS) was injected in vitreous in the contrast group. Eyes of 6 BN rats were enucleated for histological slices in 1 week, 2,4 weeks. The protein expression of nuclear factorkappa B (NFκB), monocyte chemoattractant protein1(MCP1), factorⅧrelated antigen(FⅧRAg)was examined by immunohistochemical method, and the transcription of vascular endothelial growth factor mRNA(VEGFmRNA) was Examined by in situ hybridization, meanwhile semiquantitative analysis was conducted.RESULTS: In treatment group, the positive stain optical density of NFκB, MCP1, FⅧRAg, and VEGFmRNA was obviously lower the contemporaneous control group(P<0.05).CONCLUSION: TA can lower the expression of VEGF mRNA transcription and the protein expression of NFκB, MCP1 and FⅧRAg, so it can effectively inhibit the development of BN rat CNV, which indicats that TA is an effective drug to treat CNV.

　　KEYWORDS：triamcinolone acetonide; choroidal neovascularization; nuclear factorkappa B; monocyte chemoattractant protein1; vascular endothelial growth factor; factor Ⅷrelated antigen; integrated optical density

　0引言教育論文發表網

　　人們對濕性ARMD所致的CNV的治療方法做了大量臨床和實驗研究,目前尚無確切療法，主要有激光光凝、玻璃體手術切除CNV和放射治療。這些方法不可避免地有損傷健康組織的潛在危險。藥物治療方法如皮質類固醇[1]、抗血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶抑制劑、脫氧氟尿嘧啶核苷和煙曲霉素類似物等正逐漸引起人們關注，其療效有待進一步臨床觀察。我們僅采用光凝后即刻BN大鼠玻璃體腔內注射曲安奈德(TA)的方法來探討該藥對激光光凝誘導的CNV的發生發展的抑制作用及機制。

　　1材料和方法

　　1.1材料氪激光機(美國Coherent公司，型號Novua 2000);Topcon OMS300型眼科手術顯微鏡;微量進樣器(25μL)(上海安亭微量進樣器廠);ImageProPlus 5.1圖像分析系統(美國Media cybernetics公司)。TA注射液(1mL:40mg)(昆明積大制藥有限公司);兔抗人FⅧRAgmAb(北京中杉金橋生物技術有限公司);兔抗大鼠MCP1多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司);小鼠抗大鼠的NFκBmAb 0.1mL(北京中杉金橋生物技術有限公司);即用型SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);SP9002免疫組化染色試劑盒;VEGF原位雜交檢測試劑盒。

　　1.2方法健康雄性BN大鼠36只，體質量200～220g，隨機分為兩組，實驗組和對照組。復方托品酰胺滴眼液雙眼散瞳，左下ip 100g/L水合氯醛溶液3.0mL/kg麻醉，檢查雙眼前節和眼底均正常。隨機選取1眼作實驗眼，滴10g/L甲基纖維素后，依照趙世紅等[2]的方法建立CNV動物模型，另1眼不光凝為正常眼。全身麻醉狀態下，丁卡因滴眼液表面麻醉后，手術顯微鏡下，30G針頭顳側角膜緣后0.5mm作一穿刺口，微量注射器從穿刺口進針，大約為1.5mm深，針尖朝向視神經方向，玻璃體中可見針尖，緩緩注入TA 8μL(320μg)，由散大的瞳孔可觀察到玻璃體中TA的白色混懸液體，輕輕拔針后，顯微鑷子輕夾穿刺口片刻，以利穿刺口閉合。對照組BN大鼠玻璃體內注射同樣容量的等滲的BSS液。因注射造成晶狀體損傷的眼均被排除實驗。光凝后在 1，2，4wk觀察各實驗指標，每組大鼠6只。深度麻醉下摘除眼球，DEPC處理過的蒸餾水沖洗，置于40g/L PFA0.1mol/L PBSDEPC液中固定2h。按病理組織學方法梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋，蠟塊4℃保存備用。眼球組織5μm厚度連續切片，置于50℃ DEPC處理過的蒸餾水中展片，撈片，置烤箱37℃烤片12h后，4℃保存，備用做HE染色、免疫組化及原位雜交檢測。教育論文發表網

　　1.2.1 MCP1，NFκB及FⅧRAg表達的檢測石蠟切片，常規脫蠟至水;30mL/L H2O2室溫孵育10min，阻斷內源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min;切片置于盛有0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液的抗原修復盒中，微波中火加熱15min進行抗原微波爐熱修復，自然冷卻30min;滴加50g/L BSA封閉液，室溫20min。滴加一抗兔抗大鼠MCP1多克隆抗體(1∶70)，4℃過夜;滴加生物素化山羊抗兔IgG(二抗)，37°C孵育20min;滴加SABC，37°C孵育20min;滴加AEC，室溫顯色，鏡下控制反應時間(3～10min)，蒸餾水充分洗滌;蘇木素輕度襯染10s，自來水充分水洗，水溶性封片劑封片。另組織切片脫蠟至水，滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育15min;滴加一抗小鼠抗大鼠的NFκBmAb(1∶70)，4℃過夜;滴加生物素化二抗-生物素標記山羊抗小鼠IgG，室溫孵育15min;滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37℃孵育40min;余同MCP1。另抗原修復采用滴加1g/L胰酶消化液，室溫10min;滴加50g/L BSA封閉液，室溫20min;滴加一抗兔抗人FⅧRAgmAb(1∶100)，4℃過夜;余同MCP1。用0.01mol/L PBS取代一抗孵育，作為陰性對照，試劑盒中已知陽性切片作為陽性對照。切片內被染成紅色的點、團簇為陽性反應物。

　　1.2.2 VEGF表達的檢測石蠟切片常規脫蠟至DEPCH2O;30mL/L H2O2室溫10min，滅活內源性酶;切片上滴加30g/L胃蛋白酶室溫消化10min，暴露mRNA片段;滴加預雜交液20μL，于含200mL/L甘油20mL的雜交濕盒中40℃預雜交3h;滴加含VEGF寡核苷酸標記探針的雜交液20μL，原位雜交專用蓋玻片蓋在玻片上，置濕盒中于42℃雜交18h;滴加封閉液，37℃ 30min;滴加生物素化鼠表1 FⅧRAg，VEGFmRNA表達的變化(±s,n=6)表2 NFκB和MCP1的變化(±s,n=6)

　　抗地高辛，37℃孵育1h;滴加SABC，37℃孵育30min;生物素化過氧化物酶37℃孵育20min;AEC室溫顯色，鏡下控制反應時間;蘇木素復染20s，充分水洗，GVA水溶性封片劑封片。呈團簇、點狀的紅色著色為陽性。用不含探針的雜交液進行雜交作為陰性對照，試劑盒中已知陽性切片作為陽性對照。應用ImagePro Plus 5.1圖像分析系統(美國Media cybernetics公司)對NFκB，MCP1和FⅧRAg的陽性著色光密度、VEGFmRNA陽性著色光密度進行半定量分析。每例標本400倍光鏡下，選取連續切片中含有最大CNV直徑的切片，對細胞因子的蛋白及基因表達陽性著色光密度進行IOD測量，取平均IOD值作為1例標本的觀察值，每個觀察時間點，均為6個實驗動物。

　　統計學分析：所得數據均用±s表示。應用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學處理，分析組內差異的顯著性用單因素方差分析，兩兩比較用SNK檢驗，同一時間內的組間比較用Student t檢驗。

　2結果教育論文發表網

　　2.1 FⅧRAg和VEGFmRNA表達的變化用藥組FⅧRAg蛋白表達隨時間呈逐漸增加的趨勢，早期為微量的點狀的FⅧRAg的蛋白表達，1wk與2wk之間無統計學差異，在4wk時表達略增加，與2wk時相比具有統計學差異(P<0.05);同一時間內兩組之間相比具有顯著的統計學差異(P<0.05，圖1)，可見在對照組的CNV組織中的FⅧRAg大量表達，并且隨CNV生長其表達大大增加，逐漸圍成管腔狀(圖1A′，B′)。VEGFmRNA的表達在用藥組的CNV中較低，在1，2wk時有微弱的點狀陽性著色，在4wk時增加，且與2wk相比有顯著的統計學差異(P<0.05)，但均顯著地低于同時期對照組的VEGFmRNA的表達(圖2A，B，P<0.05)。

　　2.2 NFκB和MCP1表達的變化用藥組NFκB的表達隨時間呈逐漸增加的趨勢，CNV形成不明顯(圖3)，但在4wk時間內NFκB的表達組內無明顯差異;對照組中NFκB的表達呈增加的趨勢(P<0.05)，同時期內兩組之間相比具有顯著的統計學差異(P<0.05，圖3)。MCP1的免疫組化檢查顯示：在4wk時間內，用藥組的MCP1蛋白表達隨CNV的生長而逐漸增強(P<0.05)，但與同時期的對照組相比具有顯著的統計學差異(P<0.05)，用藥組蛋白表達遠遠低于對照組(圖4)。

　　3討論

　　CNV可導致不可逆性的中心視力損害，是許多脈絡膜視網膜疾病的最終結局。治療CNV的關鍵在于阻斷其發展過程，藥物治療是最有希望阻斷病變發展進程的方法，早期使用抗血管生成藥物來控制CNV的發生、發展逐漸受到重視，如皮質類固醇[1]就是其中之一。近期，人們開始關注采用TA玻璃體腔注射治療眼內新生血管形成。已有學者通過各種臨床或實驗研究發現TA可抑制視網膜脈絡膜新生血管形成[13]，但其機制還未知。FⅧRAg是已經公認的血管內皮細胞標記物。我們采用病理組織切片檢測FⅧRAg表達，觀察TA對CNV的治療作用。1，2wk時，FⅧRAg在用藥組表達無明顯差異，4wk略增加，但均較同時期對照組明顯降低，證實了光凝后即刻玻璃體腔內注射TA 8μL顯著地抑制新生血管形成和發展。Ciulla等[1]在BN大鼠CNV動物模型中，激光光凝后即刻玻璃體腔內注射TA 20μL后，在激光斑中未見到明顯的纖維血管膜形成，且在激光斑處巨噬細胞浸潤減少，認為TA通過抑制白細胞和巨噬細胞釋放血管形成因子而發揮抑制CNV的作用。最近，有臨床資料證實玻璃體腔內注射25mg的TA可以抑制ARMD患者的新生血管[4]。TA治療CNV的機制還未知，我們通過免疫組化及原位雜交的方法檢查，可見在CNV生長的4wk時間內，在對照組中，MCP1表達隨CNV的生長呈增加的趨勢;NFκB的表達也隨CNV生長而增強;VEGF mRNA的轉錄也逐漸增強。上述細胞因子可能通過多種不同的機制參與了CNV的生長發展，而NFκB作為轉錄調控細胞因子，通過上調其它細胞因子的表達，起始和促進了CNV的生長。其中，VEGF是促進CNV形成的一個主要細胞因子，MCP1作為最有效的巨噬細胞趨化因子，促進了巨噬細胞浸潤到脈絡膜組織中而促使CNV形成。在本實驗中，我們觀察TA對于這些細胞因子轉錄和表達的影響。已知MCP1基因和VEGF的基因[5]的啟動子區含有NFκB的結合位點或識別位點，而糖皮質激素是NFκB的藥物抑制劑[6]。本實驗研究中，我們采用激光光凝后即刻在BN大鼠玻璃體腔內注射TA，發現在激光斑處CNV組織中的NFκB的表達較同時期對照組相比大大降低。有學者研究發現地塞米松可以選擇性的抑制NFκBP65亞單位，通過抑制NFκB而發揮抗炎作用。這與本實驗研究結果一致，TA可以降低BN大鼠激光斑損傷區中的NFκB活性，由此引起MCP1表達及VEGFmRNA轉錄下調，抑制了激光斑損傷處的炎癥反應，達到治療效果。MCP1表達的降低還減少了巨噬細胞在CNV組織中的浸潤，降低了RPE細胞的移行增殖，也抑制了CNV的形成和生長。Kato等[7]進行體外研究，在暴露于氧化應激環境中的RPE細胞中加入不同濃度的TA，研究TA對VEGF及結締組織生長因子表達的影響，發現可以降低VEGF和結締組織生長因子的表達，并且與TA的濃度存在依賴關系。我們采用的是在激光光凝后即刻玻璃體內注射曲安奈德，光凝后RPE細胞及脈絡膜血管內皮細胞等被激活，故TA可以對已經活化了的細胞發揮有效的作用。本研究表明，光凝后即刻玻璃體腔內注射TA大大降低了CNV的形成，抑制NFκB活化，下調靶基因VEGF mRNA、降低MCP1等表達，或直接地作用于活化的血管內皮細胞、巨噬細胞、RPE細胞等抑制血管形成因子的分泌，從而抑制了CNV的形成發展。此外，有臨床資料表明TA治療CNV除抑制新生血管的生長，還能夠改善視力，為這種療法的可行性提供了科學根據。盡管TA玻璃體內注射在某些方面還存在一些爭議，其生物學效應仍需進行更為深入的研究，目前國際上缺乏大樣本、多中心、雙盲、隨機對照研究，而且有一些還處于動物實驗階段，但是對于許多難治性的眼底疾病，如黃斑下CNV，復發性CNV，已顯示出一定的優越性[8]。我們發現，在BN大鼠CNV模型中激光光凝后即刻玻璃體腔內注射TA，可抑制NFκB及其靶基因VEGF，MCP1的表達，抑制CNV生長，TA是阻斷CNV病程發展的理想藥物。

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