細粒棘球絳蟲成蟲全長cDNA質粒文庫的構建及鑒定

【摘要】  　　目的：構建細粒棘球絳蟲（E.g.）成蟲全長cDNA質粒文庫，并檢測文庫質量。方法:提取E.g.成蟲mRNA，應用SMART方法構建pBluescript II SK全長cDNA質粒文庫，檢測文庫的重組率及容量；用載體克隆位點兩端的引物進行PCR擴增，檢測插入片段大小。隨機挑選陽性重組克隆5′端測序，歸并unigene，計算unigene得率，全長性判定主要根據同源全長基因5'末端進行比較判定并計算全長率。結果:成功構建E.g.成蟲全長cDNA質粒文庫。文庫的重組率為95.04%，庫容量1.13×106；平均插入片段長度約為1.2kb。24個隨機陽性克隆測序，unigene比例為69.57%，全長性比率為64.71％。結論:成功構建E.g.成蟲全長cDNA質粒文庫，文庫質量良好。

【關鍵詞】  細粒棘球絳蟲；成蟲；全長cDNA質粒文庫；構建；鑒定

　　［ABSTRACT］ Objective: To construct and eva luate full�睱ength cDNA library of adult Echinococcus granulosus（E.g.）. Methods:mRNA was extracted from the adult E.g. and used for the construction of full�瞝ength cDNA library using SMART�瞤BluescriptⅡSK kit. The recombination rate and capability of the library was measured and the length of insert fraction of the positive recombinant clones was tested by PCR. Positive recombinant clones were randomly selected for 5'end sequencing and the rates of unigene, full�瞝ength cDNA was analyzed by EST data using bioinformatics. Results: The full�瞝ength cDNA libray of adult E.g. was constructed successfully.The recombination rate and capability of the library were 95.04% and 1.13×106, respectively.The average length of insert fraction was about 1.2kb. 24 recombinant clones randomly selected were sequenced, the rate of unigene and full�瞝ength cDNA were 69.57% and 64.71%. Conclusions: A high�瞦uality of full�瞝ength cDNA plasmid library of adult E.g. has been constructed successfully.科學論文發表 
   
　　［KEY WORDS］ Echinococcus granulosus;Adult; Full�瞝ength cDNA plasmid library; Construction; eva luation

　　細粒棘球絳蟲（Echinococcus granulosus，E.g.）成蟲寄生于犬科動物小腸，其中絳期幼蟲細粒棘球蚴（包蟲，echinococcus cyst/hydatid cyst）寄生在中間宿主偶蹄類家畜（羊、牛、馬等）及人的多種器官、組織內，引起以占位性病變為主要臨床表現的囊型包蟲病（cystic echinococcosis，CE），是一種嚴重危害人類健康和畜牧業生產的人畜共患寄生蟲病。CE分布于世界許多國家的牧區，我國是CE的主要流行區之一，主要分布于西北牧區。CE是我國乃至世界一個重要的公共衛生及經濟問題［1］，已被列入我國十一五重大寄生蟲病防治項目。疫苗及早期診斷是其防治的關鍵，目前尚無成熟的疫苗及診斷試劑。該蟲的基因組學及功能基因組學尚未開展，已知基因甚少，不利于對相關基礎問題的研究，更不利于相關疫苗、診斷試劑及藥物的研究。
   
　　本研究目的在于通過構建E.g.成蟲全長cDNA質粒文庫并對文庫質量進行鑒定，為大規模表達序列標簽（expressed sequence tag，EST）測序，開展基因表達譜分析，克隆和鑒定一批功能基因全長cDNA序列，并為開展重要基因的功能研究打下基礎。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料與試劑
   
　　E.g.成蟲標本采自青海省西寧市人工感染犬小腸，用滅菌生理鹽水漂洗3次后液氮凍存。試劑：Trizol 總RNA提取試劑盒、1 kb DNA 梯度標記物 為GIBCO BRL公司產品；SMART IV 寡核苷酸，CDS III/3JPCR 引物，pBluescript II SK的改造載體（將EcoR I和Not I之間的序列改造為Sfi I A和Sfi I B接頭序列），由上海聯合基因公司合成和提供；DH��5α感受態菌，通用合成引物M13+/M13�玻�異丙基�拨陋睤�擦虼�半乳糖苷（IPTG）和x�瞘al為上海生工生物工程技術有限公司產品；質粒抽提試劑盒，荷蘭QIAGEN公司產品；DYEnamicTM ET DYE Terminator Kit（MegaBACETM）為美國Amersham Biosciences產品；Milli�睶水純化系統，美國Millipore公司產品；SpectraMax Plus384連續波長酶標儀，美國Molecular Devices公司產品；FR��280電泳儀，上海復日公司產品；HYBAID PCR EXPRESS PCR儀，英國Thermo Hybaid公司產品；ABI PRISM 3700測序儀，美國PE ABI公司產品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  全長cDNA質粒文庫的構建

　　1.2.1.1  樣品總RNA抽提及mRNA純化

　　按提取試劑盒操作說明書抽提總RNA產物，于260nm及280nm測吸光度（A260及A280），計算A260/A280比值判定純度（純RNA A260/ A280=1.9-2.1），1.1%瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。
   
　　根據QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits操作說明書進行分離，A260及A280檢測及1.1%瓊脂糖電泳檢測抽提結果。

　　1.2.1.2  cDNA第一鏈合成

　　0.5mL滅菌離心管中加入以下試劑： 2μg 樣品 RNA，1μL SMART IV Oligonucleotide，1 μLCDS III/3' PCR Primer，加水補足5μL，混勻試劑并稍離心，72℃溫浴2min，冰浴2min，稍離心后加入下列試劑：2.0μL 5×First�睸trand Buffer，1.0μL DTT (20mmol/L)，1.0μL dNTP Mix (10mmol/L)，1.0μL PowerScript Reverse Transcriptase，總反應體系