褪黑素對(duì)Aβ誘導(dǎo)的大鼠腦組織GFAP和S100β蛋白表達(dá)的干預(yù)作用

【摘要】  目的 觀察褪黑素(MT)干預(yù)β淀粉樣蛋白(Aβ)誘導(dǎo)的大鼠腦組織膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和S100β蛋白的表達(dá)，探討MT對(duì)老年癡呆癥(AD)治療的作用機(jī)制。方法 30只大鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、β淀粉樣蛋白(Aβ)誘導(dǎo)AD模型構(gòu)建組(模型組)和AD模型+MT治療組(MT組)。動(dòng)物喂養(yǎng)40 d時(shí)取大鼠腦組織，用HE染色觀察腦組織病理變化，免疫組化染色法檢測(cè)Aβ標(biāo)記的腦組織部位以及Aβ對(duì)神經(jīng)細(xì)胞毒性作用，同時(shí)檢測(cè)膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP和S100�拨碌鞍椎谋磉_(dá)水平。結(jié)果 HE染色觀察腦組織病變?cè)贛T組明顯輕于模型組;免疫組化結(jié)果顯示，Aβ的表達(dá)水平在模型組和MT組二者間無明顯差異，但Aβ對(duì)海馬CA3區(qū)神經(jīng)元損傷作用在模型組要大于MT組。GFAP和S100β表達(dá)水平在模型組則顯著高于MT組和正常組(P<0.05)。結(jié)論 用MT干預(yù)治療，可降低AD模型鼠膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)GFAP和S100β蛋白的水平，從而起到了減輕大腦神經(jīng)元細(xì)胞的損傷作用。

【關(guān)鍵詞】  褪黑素; 老年癡呆癥;β�驳矸蹣拥鞍�;星形膠質(zhì)細(xì)胞

　 阿爾茨海默病(AD)是一種常見的老年癡呆癥，主要表現(xiàn)為認(rèn)知能力喪失以及神經(jīng)病理性結(jié)構(gòu)損傷,包括腦組織萎縮、老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)與大量的β�驳矸蹣拥鞍�(Aβ)沉積。AD是威脅老年群體健康與壽命的最重要的疾病之一〔1〕，目前尚無有效治療方法，因此深入開展對(duì)AD發(fā)病機(jī)制研究和尋找有效治療方法具有重要意義。研究證明年齡老化和腦組織中Aβ沉積是促使AD發(fā)生發(fā)展的主要原因，與機(jī)體氧自由基產(chǎn)生增加、清除氧自由基能力下降等因素有關(guān)〔2〕。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境，活化后可分泌大量細(xì)胞因子，釋放氧自由基、激活補(bǔ)體，啟動(dòng)免疫反應(yīng)，在AD的病變中起重要作用。褪黑素(MT)是一種重要的抗衰老激素，可有效地防止大腦功能退化，減少與年齡相關(guān)的炎癥基因表達(dá)增長，并誘導(dǎo)抗氧化的基因生成;能通過血腦屏障，且價(jià)廉又無明顯毒副作用〔3〕。考慮到MT具有巨大的潛在效應(yīng)，故有可能成為一種極好的用于研究治療AD疾病的化合物。本實(shí)驗(yàn)在觀察Aβ所引起神經(jīng)毒作用的同時(shí)，重點(diǎn)探索MT干預(yù)Aβ誘導(dǎo)大鼠腦組織表達(dá)GFAP和S100β兩種蛋白水平的影響，以了解MT在Aβ沉積在腦組織所發(fā)揮的作用，為治療AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 纖維型Aβ1～42的制備 取0.5 g Aβ1～42(美國Sigma公司)溶于250 μl注射用生理鹽水中，用電動(dòng)混懸器充分混勻，置于37℃恒溫箱中孵育1 w，使其成為聚集狀態(tài)的纖維型Aβ1～42,置4℃冰箱中備用。

　　1.2 動(dòng)物分組及模型制備 成年SD雄性大鼠30只，體重180～220 g,由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，其中隨機(jī)取20只建立AD模型，10只作為正常對(duì)照組。建模方法：將SD大鼠用10%水合氯醛 (0.35 mg/kg)麻醉后置于立體定位儀上，切開皮膚，找到前囟所在位置，參考大鼠圖譜確定前囟后3.0 mm，中線旁2.0 mm為海馬的所在的體表投影位置，以牙科鉆鉆開一骨窗，將微量注射器固定在立體定位儀上，進(jìn)針約2.8 mm，緩慢均勻注入纖維型Aβ1～42溶液10 μg/5 μl,5 min注射完畢，留針5 min，然后緩慢撤針，術(shù)后縫合皮膚。對(duì)照組按照模型制備的全過程在腦內(nèi)注射生理鹽水5 μ1。建模成功后隨機(jī)分為模型組和MT用藥組，與正常組均平行給予常規(guī)飲食及正常活動(dòng)。模型組和對(duì)照組均灌胃1 ml生理鹽水，MT用藥組用褪黑素0.15 mg/kg(生理鹽水配制)灌胃，每次1 ml/d，持續(xù)40 d。論文代理發(fā)表

　　1.3 腦組織切片的制備 模型建立40 d后，將對(duì)照組、MT組和模型組三組大鼠用10%水合氯醛(0.35 mg/kg)麻醉，暴露心臟，經(jīng)左心室灌注0.01 mol/L PBS，待大鼠的肝臟顏色變淺，然后改以4%的多聚甲醛灌注，流速約為10 ml/min，并取腦組織置于4%多聚甲醛溶液中冰箱后固定過夜，次日用0.01 mol/L PBS反復(fù)浸洗，最后將腦組織梯度酒精脫水，透明，石蠟包埋，冠狀切片(厚約5 μm)備用。

　　1.4 免疫組織化學(xué)主要試劑和實(shí)驗(yàn)方法 取脫蠟切片入PBS緩沖液，經(jīng)抗原修復(fù)液(美國Vector，H��3300)80℃存放20 min，待自然冷卻后，緩沖液清洗2次，再入3% H2O2室溫下5 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶。然后，切片孵育在2%小牛血清中1 h，以減少組織非特異性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中所用抗體6E10購于美國Covance 公司(產(chǎn)品編號(hào)：SIG��39340，1∶1 000);NeuN購于Chemicon公司(產(chǎn)品編號(hào)：MAB��377，1∶1 000);S100�拨沦徲赟igma，產(chǎn)品編號(hào)：S2657，1∶100),GFAP購于美國DAKO公司(Z0334，1∶1 000)。切片分別在 1%小牛血清與0.1% Triton和上述抗體的混合液中4℃冰箱孵育過夜，次日經(jīng)緩沖液洗滌3次后,加相應(yīng)二抗(1∶400)溶液，室溫孵育1 h，緩沖液洗滌3次后，加生物素與卵白素結(jié)合(ABC)試劑盒配置的混合液中再孵育1 h。底物呈色反應(yīng)采用DAB試劑盒。所有二抗、ABC和DAB試劑盒均購自美國Vector公司。呈色反應(yīng)后，切片經(jīng)逐級(jí)脫水并用加拿大中性樹膠封片。

　　1.5 圖像采集及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 在日本產(chǎn)Nikon Eclipse 80i顯微鏡下觀察結(jié)果，并用Nikon DS高分辨率數(shù)碼相機(jī)經(jīng)NIS�睧lements AR 3.0軟件拍照。對(duì)腦組織切片均通過拍照收集皮質(zhì)和海馬切面圖像。結(jié)果分析，采用Ver.3.00程序軟件作圖像數(shù)字采集及半定量分析。結(jié)果評(píng)估采用單一方差分析，Excel軟件統(tǒng)計(jì)制表。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 Aβ在模型組和MT組腦組織的表達(dá) 6E10(Aβ1～16)抗體標(biāo)記腦組織的溶解或聚集狀態(tài)Aβ。顯微鏡下觀察在對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)Aβ的沉積，而模型組和MT組可見海馬中央以及皮質(zhì)中線旁2 mm處可見有大小不等分布不均的6E10抗體陽性反應(yīng)物表達(dá)，兩組比較沒有明顯的差異,見圖1。

　2.2 MT對(duì)Aβ的神經(jīng)細(xì)胞毒性影響 在模型組和MT組的Aβ注射的腦組織皮質(zhì)區(qū)和海馬CA3區(qū)可見神經(jīng)細(xì)胞大小不一，部分神經(jīng)細(xì)胞萎縮變形，神經(jīng)細(xì)胞帶受損，細(xì)胞數(shù)量減少，對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)上述改變，見圖2。發(fā)表論文網(wǎng)

　　圖1 Aβ在各組腦組織的表達(dá)(DAB，×100)圖2 MT對(duì)Aβ的神經(jīng)細(xì)胞毒性影響(DAB，×400)

　　2.3 各組大鼠腦組織GFAP與S100�拨碌鞍椎谋磉_(dá) GFAP和S100β蛋白在各組大鼠腦組織均有表達(dá)，GFAP在對(duì)照組的陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞染色較淺，MT和模型組兩種蛋白的陽性反應(yīng)細(xì)胞增多，染色反應(yīng)增強(qiáng)，腦組織海馬和皮質(zhì)部位均有明顯的表達(dá)，兩組反應(yīng)與對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1,圖3，圖4。表1 各組大鼠腦組織中6E10、GFAP和S��100 β表達(dá)(x±s)

　　3 討 論

　　已知腦內(nèi)發(fā)揮神經(jīng)毒作用的Aβ主要是Aβ1～40和Aβ1～42。雖然實(shí)驗(yàn)用Aβ是人工合成，但不少研究證明它幾乎和內(nèi)生性的Aβ1～42有同等毒性作用，以聚集狀態(tài)的Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元退行性病變與AD的病理改變十分相似〔4〕。本實(shí)驗(yàn)通過以纖維型Aβ進(jìn)行大鼠背側(cè)細(xì)胞帶微量注射，Aβ1～42以不溶解狀態(tài)成大分子而不被吸收，用免疫組織化學(xué)的方法用6E10抗體反應(yīng)證實(shí)Aβ存在模型鼠大腦皮質(zhì)