生姜透皮貼對運動病大鼠腦組織中三種酶活性的影響

【摘要】  目的 通過建立運動病模型，檢測生姜透皮貼對運動病大鼠腦組織中堿性磷酸酶(AOP)、Na+�睰+�睞TP酶和細胞色素氧化酶(CCO)活性的變化，并探討其治療運動病的機制。方法 雄性SD大鼠40只，隨機分5組，每組8只，每天按實驗方法刺激，同時實驗組給予生姜透皮貼治療。實驗第3天刺激結束后迅速斷頭處死，冰上迅速分離腦組織，取大腦皮質和小腦皮質、腦干前庭區(qū)。采用組織化學定位方法和圖像定量分析方法，檢測各組大鼠上述三部位腦組織中ALP、Na+�睰+�睞TP酶及CCO活性。結果 運動病大鼠三部位腦組織中ALP活性顯著升高、Na+�睰+�睞TP酶及CCO活性明顯降低。與模型組相比，使用生姜透皮貼后運動病大鼠三部位腦組織中ALP活性顯著減低、Na+�� K+�睞TP酶及CCO活性明顯升高。結論 生姜透皮貼可能通過降低腦血管緊張度，改善腦血流的分布，增加腦血流量，調整腦細胞內CCO、ALP、Na+�睰+�睞TP酶等酶的活性，增強腦細胞的興奮性，從而保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性，起到抗運動病的作用。

【關鍵詞】  生姜透皮貼;運動病;堿性磷酸酶;Na+�睰+�睞TP酶;細胞色素氧化酶

　 隨著現(xiàn)代航天航海事業(yè)的發(fā)展，世界各國都在開展運動病的研究工作，對防治運動病的研究已經(jīng)取得了一定的成果，但尚無公認的療效確切、副作用少的治療措施。尋找更為有效、更安全的抗運動病方法日益引起國內外重視。目前的抗運動病藥物主要包括抗膽堿、抗組胺類及擬交感胺類等，雖有一定的抗運動病作用，但多有中樞抑制作用，限制了其臨床使用。而我國自古就應用中草藥生姜抗眩暈病，生姜有確切的抗運動病防止暈車、暈船的作用〔1〕。美國科學家也證明生姜確有防暈船等效果〔2〕，且相對其他防暈船藥物相比，無口干，昏睡，血壓降低等副作用。近年來，國內學者進行的動物實驗證實，生姜的有效成分有明顯的止吐抗運動病的作用〔3〕，且無明顯副作用。南通醫(yī)學院航海醫(yī)學研究所與南通市中醫(yī)院聯(lián)合研究的生姜合劑由生姜、半夏等6味中藥組成〔4〕，及單獨的生姜粉等用于防治運動病，效果較暈海寧強，副作用不明顯，因而生姜成為各國學者普遍看好的新的抗運動病藥物。本實驗運用乙醇法提取生姜有效成分，將其與透皮劑氮酮混合制成帖劑貼在運動病大鼠的臍部〔5〕，測定大鼠大腦皮質、小腦皮質、腦干前庭區(qū)腦細胞中Na+�睰+�睞TP酶、堿性磷酸酶(ALP)、細胞色素氧化酶(CCO)活性變化〔6〕，透皮療法使藥效發(fā)揮更加持久，而且方法簡便，作用迅速〔7〕，為抗運動病新型藥物的研究提供新的思路。

　　1 材料與方法

　　1.1 動物及分組 雄性SD大鼠40只、體重(200±10) g，購自湖北省實驗動物中心，動物合格證號：SYXK(鄂)2003��0007，檢疫后備用。單籠飼養(yǎng)，自由攝食水，飼養(yǎng)1 w后開始實驗。隨機分5組，分別是正常組、模型組和生姜高、中、低劑量組，每組8只。模型組和生姜組大鼠臍部脫毛，每天將透皮貼貼在臍部，給藥30 min。隨后給予2 h的運動病刺激：將大鼠無束縛地放入旋轉裝置中的有機玻璃籠內，先順時針方向加速度從16°/S2加速至120°/S2，然后立即以45°/S2減速至0，馬上逆時針再以16°/S2加速至120°/S2，然后以45°/S2減速至0，如此反復。旋轉時間為2 h〔8〕，除正常組不接受旋轉刺激外，其他各組處理相同，旋轉刺激完成后動物放回飼養(yǎng)籠中。連續(xù)刺激3 d，1次/d。每天觀察動物接受刺激后的反應情況，第3天刺激結束后取動物迅速斷頭處死，冰上迅速分離腦組織，取出大鼠三部位腦組織，放入液氮，轉入-80℃冰箱備用。中國論文發(fā)表

　　1.2 藥品與材料 生姜透皮貼：生姜(華中科技大學鑒定)清洗去雜切碎，雙蒸水浸泡，閃式提取器提取，過濾，濾液減壓濃縮至浸膏狀，按50、100和200 mg/kg將生姜浸膏與氮酮混勻，制成3 cm×4 cm生姜透皮貼，另用氮酮制作空白貼劑供模型組使用。ALP試劑盒(批號：060101)、Na+�睰+�睞TP酶試劑盒(批號：060101)、CCO試劑盒(批號：060101)均購自南京建成生物工程研究所。

　　1.3 實驗儀器 低溫高速離心機(Backman)、電熱恒溫水溫箱 (上海醫(yī)療器械七廠)、721分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

　　1.4 酶細胞化學反應 將組織用含2%多聚甲醛、0.5%戊二醛的二甲砷酸鈉緩沖液固定液(pH1.4　0.1 mol/L) 4℃固定1 h。二甲砷酸鈉緩沖液漂洗后，與液氮冷凍后兩組樣品并列放在一起,恒冷箱冷凍切片為10 μm，分別測定進行Na+�睰+�睞TP酶、ALP和CCO〔9〕。用1%鋨酸固定1 h，EPON812包埋，LKB超薄片機切片，不進行電子染色，直接在HITACHI�睭300型電鏡下觀察。學術論文發(fā)表

　　1.5 酶活性定量分析 采用XY��540型彩色圖像分析系統(tǒng)定量分析〔10〕，128×128像素點，每張切片隨機測5次，酶切片反應至少測30次，以陽性反應面積(單位為μm2)作為酶反應強度的參數(shù)，取其平均值。

　　1.6 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，應用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行方差分析。

2 結 果

　　2.1 一般情況 大鼠受到運動病刺激后，自發(fā)活動明顯減少，皮毛蓬松聳立，排尿排便增多。運動病刺激結束后大鼠行為表現(xiàn)有所恢復，約3 h后開始活動或進食。與正常組比較，生姜組和模型組大鼠消瘦，進食量未見明顯改變。

　　2.2 各組大鼠大腦皮質三種酶活性 運動病大鼠大腦皮質Na+�睰+�睞TP酶、CCO陽性反應面積明顯減小，ALP陽性反應面積增大;生姜透皮貼使運動病大鼠大腦皮質中Na+�睰+�睞TP酶、CCO陽性反應面積明顯增大，ALP陽性反應面積減小，見表1。表1 大鼠大腦皮質三種酶活性的圖像定量分析(x±s，n=8)與正常組比較：1)P<0.05，2)P<0.01;與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

　　2.3 各組大鼠腦干前庭區(qū)三種酶活性 運動病大鼠腦干前庭區(qū)中Na+�睰+�睞TP酶、CCO陽性反應面積明顯減小，ALP陽性反應面積增大;生姜透皮貼使運動病大鼠腦干前庭區(qū)中ALP、Na+�睰+�睞TP酶、細胞色素氧化酶陽性反應面積明顯增大，ALP陽性反應面積減小，見表2。表2 大鼠腦干前庭區(qū)三種酶活性的圖像定量分析(x±s，n=8)

　　2.4 各組大鼠小腦皮質三種酶活性 運動病大鼠小腦皮質中Na+�睰+�睞TP酶、CCO陽性反應面積明顯減小，ALP陽性反應面積增大;生姜透皮貼使運動病大鼠小腦皮質區(qū)中ALP、Na+�睰+�睞TP酶、CCO陽性反應面積明顯增大，ALP陽性反應面積減小，見表3。表3 大鼠小腦皮質三種酶活性的圖像定量分析(x±s，n=8)

　　3 討 論

　　大腦和小腦皮質及腦干前庭區(qū)等中樞對運動病的發(fā)病有關〔11〕。ALP和Na+�睰+�睞TP酶反應產(chǎn)物主要定位于以上三部位毛細血管內皮細胞膜上，也呈陽性反應。CCO反應產(chǎn)物主要定位于以上三部位腦細胞線粒體膜上。核心期刊論文發(fā)表

　　旋轉刺激可引起神經(jīng)細胞膜Na+�睰+�睞TP酶活性下降，ALP活性上升，線粒體CCO活性下降。這可能表明旋轉刺激引起Na+�睰+泵效率明顯下降，導致細胞膜外K+濃度上升，高濃度K+可打開神經(jīng)細胞膜上電壓依賴性Ca2+通道，導致Ca2+內流。神經(jīng)細胞膜外高K+和細