Apoptin原核表達載體的構建及在大腸桿菌中的表達

【摘要】  　　目的 構建Apoptin的原核表達載體，并制備抗原物質Apoptin融合蛋白。方法 在獲得Apoptin融合基因的基礎上，成功構建了Apoptin的高效原核表達載體pET-28a(+)-Apoptin，將該質粒轉化至大腸桿菌E.coli BL21(DE3)受體菌中，以IPTG對其進行誘導表達，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析目的蛋白。結果 轉化有Apoptin的原核表達載體pET-28a(+)-Apoptin的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)經IPTG誘導后，經SDS-PAGE分析，在相對分子質量約17 000的位置出現目的蛋白條帶，大小與Apoptin融合蛋白一致。結論 Apoptin原核表達載體pET-28a(+)-Apoptin能夠表達出Apoptin融合蛋白，為進一步的Apoptin研究和制備Apoptin抗體奠定了基礎。

【關鍵詞】  Apoptin 原核表達載體 pET-28a(+) 大腸桿菌

　　ABSTRACT: Objective  To construct an Apoptin prokaryotic vector, aiming to produce antigenic fusion protein Apoptin. Methods  The Apoptin gene was amplified from the template of plasmid pSSCHG/NT4-Apoptin- HA2-TAT by PCR. The Apoptin was sub-cloned into the multiple clone sites of plasmid pET-28a (+) to get the prokaryotic vector of pET-28a (+)-Apoptin, which was transformed into E.coli BL21 (DE3). Expression of E.coli BL21 (DE3) was induced by IPTG. The specific protein expression was detected by SDS-PAGE. Results  The fusion protein was expressed with high efficiency in E.coli BL21 (DE3) transformed by pET-28a (+)-Apoptin after induction with IPTG. The specific fusion protein had an apparent related molecular weight of about 17 000 ku as indicated by SDA-PAGE analysis. Conclusion  The Apoptin prokaryotic expression vector with pET-28a (+)-Apoptin can effectively express Apoptin fusion protein, laying a foundation for further study of Apoptin and preparation of antibodies against Apoptin.

　　KEY WORDS: Apoptin; prokaryotic expression vector; pET-28a (+); E.coli

　　目的基因或載體對正常組織的毒性和腫瘤細胞對治療的耐受等是限制腫瘤基因治療臨床應用的瓶頸。Apoptin(凋亡素)的發現突破了上述瓶頸，給抗腫瘤的基因治療帶來了轉機。Apoptin是雞貧血病毒(chicken anemia virus, CAV)的vp3基因編碼的蛋白質，體外合成或基因工程表達的Apoptin能特異的引起多種人源性惡性腫瘤細胞凋亡，對正常二倍體體細胞無作用；且這種選擇性凋亡作用既不依賴于p53的介導，也不被bcl-2過表達所抑制［1］，顯示其可能在腫瘤基因治療中具有迷人的應用前景。本實驗在獲得CAV Apoptin基因的基礎上，構建Apoptin的原核表達載體(圖1)，為下一步表達特異性蛋白產物、制備Apoptin抗體奠定基礎［2］。

　　1  材料與方法護理論文發表

　　1.1  質粒、菌株、工具酶及試劑
 
　　含Apoptin全基因組序列的體外克隆NT4-Apoptin-HA2-TAT重組腺相關病毒由本課題組構建［2］；大腸桿菌Top10、大腸桿菌BL21均來自西安華廣生物工程公司；質粒pGEM-T Easy購自Promega公司；質粒pET-28a(+)購自Novegen公司；限制性內切酶、Taq聚合酶購自華美生物公司；T4 DNA 連接酶購自MBI公司；主要試劑為國產或進口分析純。

　　1.2  引物的設計和合成

　　根據前期研究的Apoptin基因序列的結果［2］，按照載體上正確的插入方向和譯讀框架設計一對引物。引物的5′端分別添加了限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切序列。擴增的片段包括Apoptin完整的基因序列。上游引物：5′-GGAATTCATGAACGCTCTCCAAGAAG-3′；下游引物：5′-GCTCGAGTCACAGTCTTATACGCCTTCTTG-3′(下劃線處分別為EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切序列)，由上海生工生物工程公司負責合成，用PAGE純化。

　　1.3  目的基因的擴增和純化

　　以含有Apoptin全基因組序列的pSSCHG/NT4-Apoptin-HA2-TAT為模板，上下游引物各50 pmol，10×PCR反應緩沖液10 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，加超凈水至終體積為49 μL。94 ℃預變性5 min、94 ℃變性1 min、50 ℃退火1 min后，再加入1 μL Taq DNA聚合酶。進行94 ℃變性1 min、50 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min 30個循環，72 ℃繼續延伸5 min。經酚/氯仿抽提，無水乙醇沉淀，70%(體積分數)乙醇洗滌沉淀后用30 μL TE充分溶解沉淀。取少量PCR產物進行10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外線測定A260值對產物進行定量。

　　1.4  重組質粒pGEM-T Easy/Apoptin(pT/Apoptin)的構建與鑒定 教育教學論文發表

　　取上述PCR產物600 ng(0.2 g/L)、質粒pGEM-T Easy 25 ng(50 g/L)、T4DNA連接酶5 u(5 u/μL)、10×T4 DNA連接酶緩沖液2.5 μL以及去離子水18 μL(總體積25 μL)建立連接反應體系，23 ℃水浴1h。取10 μL連接產物轉化100 μL感受態大腸桿菌Top10，涂布LB(Amp+)平皿，37 ℃倒置過夜。從LB平皿中挑選單菌落用堿裂解法，經EcoRⅠ酶切后瓊脂糖凝膠電泳，篩選出正確重組質粒進行大量制備。對含有目的基因的重組質粒進行DNA測序(上海生工生物工程公司)。

　　1.5  重組質粒pET-28a(+)-Apoptin的構建和鑒定

　　將測序正確的重組質粒pGEM-T Easy/Apoptin、pET-28a(+)分別進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，各取1 μL酶切產物、1 μLT4DNA連接酶、10×T4DNA連接酶緩沖液2.5 μL、去離子水18.5 μL(總體積25 μL)，16 ℃水浴過夜。取10 μL連接產物轉化100 μL感受態大腸桿菌