幽門螺桿菌尿素通道蛋白基因UreI載體的構(gòu)建、融合表達(dá)及純化

【摘要】  　　目的 構(gòu)建幽門螺桿菌(H.pylori, Hp)尿素通道蛋白基因UreI的融合表達(dá)載體，并在E.coli BL21中表達(dá)，為進(jìn)一步研究UreI的功能奠定基礎(chǔ)。方法 利用分子克隆技術(shù)以Hp DNA染色體為模板，擴(kuò)增Hp UreI基因片段，將目的基因UreI與載體pET32a(+)分別經(jīng)kpnⅠ和HindⅢ雙酶切，純化，連接。篩選陽性重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)pET32a(+)/UreI融合蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖樹脂純化后，用SDS-PAGE及Western blot分析。結(jié)果 經(jīng)酶切、測序分析表明，插入的基因片段為Hp UreI編碼基因，由585 bp組成，與GenBank相應(yīng)菌株HP AM417 609序列完全一致，無堿基突變。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示重組質(zhì)粒pET32a(+)/UreI在原核細(xì)胞中得到了高效融合表達(dá)，其重組融合蛋白分子量為130 ku，經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖樹脂純化后，其純度達(dá)95%以上，Western blot分析顯示，該重組融合蛋白可被6-His鼠抗單克隆抗體所識別，具有良好的反應(yīng)原性。結(jié)論 成功地克隆和構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32a(+)/UreI，并在原核細(xì)胞中得到了高效融合表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】  幽門螺桿菌 尿素通道蛋白(UreI) 原核表達(dá)

　　ABSTRACT: Objective  To construct the prokaryotic expression vector of the urea channel protein gene (UreI) of Helicobacter pylori and make it expressed in E.coli BL21. Methods  The target gene encoding UreI was amplified from Hp DNA by PCR, digested by restricted endonuclease enzyme of HindⅢ, KpnⅠ simultaneously, and inserted into prokaryotic expression vector pET32a(+) digested by corresponding restricted endonuclease enzyme. The recombinant plasmid was used to select and identify by restricted endonuclease enzyme digestion and sequence analysis and transform, meanwhile induce it to be expressed in E.coli BL21 by IPTG. The recombination fusion protein was purified by 6-His marked Ni-TEDTM kit and analysed by Western blot. Results  Restriction endonuclease analysis and sequencing showed that the target gene was found to be 585 base pairs and had been inserted into recombinant vector. As compared with gene HP AM417 609 reported by GenBank, cloned UreI gene sequence was completely matched and composed of 585 bp. SDS-PAGE analysis showed that the recombinant plasmid pET32a(+)/UreI could be expressed in E.coli BL21, its relative molecule mass of expressed product was 130 ku. After purified with Ni-NTA agarose resin, the purity of recombinant fusion protein was about 95%. Western blot results showed that the recombinant fusion protein could be identified by anti-6-His monocloned antibody, suggesting that this fusion protein has good reactionogenicity. Conclusion  The gene coding for UreI is cloned and expressed successfully.

　　KEY WORDS: Helicobacter pylori; urea channel protein gene (UreI); prokaryotic expression

　　幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)是上消化道疾病的主要致病菌，它的感染不但與B型胃炎和消化性潰瘍的發(fā)生有密切關(guān)系，而且與非潰瘍性消化不良、MALT淋巴瘤和胃癌的發(fā)生也有重要關(guān)系，并已被世界衛(wèi)生組織列為胃癌等腫瘤發(fā)生的相關(guān)因素［1］。Hp在我國普通人群的感染率較高(50%-80%)，并仍以每年1%-2%速度增加［2］。目前認(rèn)為Hp的免疫防治將是減少胃癌以及消化性潰瘍的最有效和最經(jīng)濟(jì)的辦法。

　　幽門螺桿菌尿素通道蛋白(UreI)在Hp致病中起到了最為關(guān)鍵的作用。在酸性環(huán)境下，UreI激活尿素酶分解尿素產(chǎn)生氨，而氨的生成是Hp對抗胃酸、耐受胃酸以及在胃內(nèi)定植的基礎(chǔ)，因此UreI是Hp在胃內(nèi)定植最關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)［3］。Hp的持續(xù)感染與UreI有重要的關(guān)系，抑制UreI的表達(dá)，從而抑制尿素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，使Hp對酸不耐受，進(jìn)而不能在胃內(nèi)強(qiáng)酸環(huán)境中定居，達(dá)到根除Hp及其相關(guān)疾病的目的，因此以UreI為抗原的Hp疫苗將具有廣闊的應(yīng)用前景。本文對Hp尿素通道蛋白UreI基因進(jìn)行克隆，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a(+)/UreI,并在E.coli中進(jìn)行表達(dá)，為進(jìn)一步研究UreI的功能奠定基礎(chǔ)。

　　1  材料與方法

　　1.1  菌株和質(zhì)粒

　　Hp由本校微生物學(xué)教研室提供，DH5α菌株，BL21(DE3)表達(dá)菌和pET32a(+)載體為本校病毒性肝炎所保存。限制性內(nèi)切酶HindⅢ、KpnⅠ及Tag DNA聚合酶購自TaKaRa大連公司，T4DNA連接酶購自Promega公司。柱離心式膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)mega公司。鼠抗6-His單抗、羊抗鼠IgG-HRP購自北京中山公司。

　　1.2  基因組DNA的提取 護(hù)理論文發(fā)表

　　參考文獻(xiàn)報(bào)道［4］，取1.5 mL Hp培養(yǎng)物，12 000 r/min，離心2 min。取沉淀，加入567 μL的TE緩沖液，混懸。再加入100 g/L SDS 30 μL和20 g/L蛋白酶K 3 μL，于37 ℃溫育1 h。依次加入5 mol/L NaCl 100 μL和100 g/L SDS 80 μL，于65 ℃溫育10 min。用酚及酚/氯仿各抽提3次，收集上清液轉(zhuǎn)入EP管中，加入0.6倍于上清液的異丙醇，12 000 r/min，離心15 s。取沉淀，加入700 mL/L乙醇1 mL洗滌，再以12 000 r/min離心5 min。棄上清液，將沉淀溶于100 μL TE中，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.3