淺談禽用疫苗安全性的檢測(cè)方法

【內(nèi)容摘要】：疫苗是一種特殊藥品，其質(zhì)量?jī)?yōu)劣直接關(guān)系到畜禽疾病預(yù)防的有效性和安全性，也關(guān)系到對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境的影響。因此對(duì)疫苗的生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)和使用必須有嚴(yán)格的監(jiān)督管理和檢測(cè)。
【關(guān)鍵詞】: 疫苗 安全 檢測(cè)
疫苗(Vaccine) 指的是由病原微生物、寄生蟲以及其組分或代謝產(chǎn)物所制成的，通過疫苗免疫是最有效的防控疫病措施之一。
疫苗是一種特殊藥品，其質(zhì)量?jī)?yōu)劣直接關(guān)系到畜禽疾病預(yù)防的有效性和安全性，也關(guān)系到對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境的影響。因此對(duì)疫苗的生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)和使用必須有嚴(yán)格的監(jiān)督管理和檢測(cè)。我國(guó)疫苗的檢測(cè)是按照農(nóng)業(yè)部頒布的《獸醫(yī)生物制品及檢驗(yàn)規(guī)程》來進(jìn)行，疫苗的檢測(cè)包括安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)、物理性狀檢驗(yàn)等相關(guān)檢驗(yàn)。為了保證在養(yǎng)禽生產(chǎn)中使用安全高效的禽用疫苗，各養(yǎng)殖場(chǎng)須在疫苗使用前進(jìn)行安全性檢測(cè)。
目前，禽用活疫苗外源病原檢測(cè)項(xiàng)目有。
1 無菌檢驗(yàn)或純粹檢驗(yàn)
1.1 無菌檢驗(yàn)
厭氧性及需氧性細(xì)菌的檢驗(yàn)用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G） 及酪胨瓊脂（G.A）；霉菌及腐生菌檢驗(yàn)用葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（G.P）。
1.2 滅活檢驗(yàn)
用適于本菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基或?qū)Ρ径久舾械募?xì)胞、組織和動(dòng)物。
1.3 檢驗(yàn)方法及結(jié)果判定
（1）含甲醛、苯酚、汞類等防腐劑和抗生素的制品用T.G 培養(yǎng)基 50ml，接種樣品 1ml （凍干制品先用 5ml 生理鹽水稀釋）， 置37℃培養(yǎng)，3 日后自小瓶中吸取培養(yǎng)物分別接種T.G 小管和G.A 斜面各2 支，每支0.2ml，1 支置37℃ ,1 支置25℃ ；另取0.2ml 接種1 支G.P 小管置25℃，均培養(yǎng)5 日，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。
（2）細(xì)菌性活疫苗及不含防腐劑、抗生素的其它制品或稀釋液將樣品直接接種T.G 小管和G.A 斜面各2 支，每支0.2ml， 1 支置37 ℃ ,1 支置25℃ ；另取0.2ml 接種1 支G.P 小管置25℃，均培養(yǎng)5 日，細(xì)菌性活疫苗應(yīng)純粹，其他制品應(yīng)無菌生長(zhǎng)。
2 雜菌計(jì)數(shù)
2.1 樣品稀釋
隨機(jī)抽取3 瓶試驗(yàn)樣品，用酒精棉消毒瓶塞后加入TSB 培養(yǎng)基對(duì)疫苗進(jìn)行稀釋，最終使接種疫苗稀釋液為10 羽份/0.3ml。
2.2 接種
取10 塊GA 培養(yǎng)基平皿，在平皿上做好標(biāo)記，每個(gè)樣品接種3 個(gè)平皿，每平皿接種0.3ml，傾斜平皿讓接種物均勻分布到瓊脂表面，設(shè)一陰性對(duì)照。置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h 后轉(zhuǎn)移至25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。
2.3 計(jì)數(shù)
將培養(yǎng)結(jié)束的平皿取出，分別計(jì)算雜菌數(shù)，如果污染霉菌亦作為雜菌計(jì)數(shù)。根據(jù)平皿上的細(xì)菌數(shù)和霉菌數(shù)以及每塊平皿上接種的疫苗羽份數(shù)量，用下面的公式計(jì)算每個(gè)樣品每羽份所含的雜菌數(shù)。
每羽份雜菌數(shù)（雜菌數(shù)/ 份數(shù)）=
S1、S2、S3: 為第一、二、三塊平皿雜菌數(shù)。D ：為每塊平皿上接種的疫苗雜菌數(shù)。
2.4 結(jié)果判定
陰性對(duì)照平皿無菌生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)有效。任何一瓶待檢樣品每羽份疫苗雜菌不超過1 個(gè)為合格，3 個(gè)樣品中任何一個(gè)樣品每羽份雜菌計(jì)數(shù)超過1 個(gè)菌，則該產(chǎn)品不合格。
3 外源病毒檢驗(yàn)—雞胚法
3.1 檢測(cè)方法
（1）雞胚檢測(cè)法分為：絨毛尿囊膜接種（CAM）和尿囊腔接種(AS)。
（2）雞檢查法：用雞胚檢測(cè)無結(jié)果或可疑時(shí)，可用雞檢1 次，檢查臨床反應(yīng)及某些病原的抗體反應(yīng)。
3.2 外源病毒檢驗(yàn)時(shí)樣品稀釋的稀釋與中和
每批疫苗取樣2 瓶，將待檢樣品稀釋成每毫升含250 羽份（1000 羽份疫苗加入4ml 無菌PBS 溶液），混合2 瓶疫苗稀釋液， 取出 1ml （250 羽份），加入 3ml 相應(yīng)的抗血清，室溫中和 1h，接 種前再加入1ml PBS 使總體積為5ml。如為聯(lián)苗則需加入每種抗血清各2ml 中和1h。
3.3 接種
雞胚源疫苗與相應(yīng)抗血清混合室溫中和1h 后，取9-11 日齡SPF 雞胚10 只，通過CAM 和AS 2 個(gè)途徑分別接種雞胚10 只，每胚接種0.2ml。放置孵化機(jī)中孵化7 天，24h 內(nèi)死亡雞胚不計(jì)，孵化7 天后每組至少存活8 個(gè)胚試驗(yàn)才有效。
3.4 結(jié)果判定
7 天后，打開所有雞胚（包括24h 后死亡雞胚）進(jìn)行解剖觀察，雞胚發(fā)育正常，絨毛尿囊膜無病變，尿囊液HA 為陰性。則檢驗(yàn)樣品合格。如果因?yàn)橥庠床《疽�起雞胚死亡或病變，則該批疫苗不合格。
4 外源病毒檢驗(yàn)—RT-PCR 檢測(cè)方法
4.1RNA 的抽提
按照RNA 抽提試劑盒說明書進(jìn)行
4.2RT-PCR 反應(yīng)液的配制
反應(yīng)體系：使用TaKaRa PrimeScript One step RT-PCR Kit Ver.2（TaKaRa Code ：DRR055A）PCR 試劑盒，反應(yīng)體系為25ul 體系，具體如下：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1ul ；2×1 Step Buffer 12.5ul ；S1、S2 各1ul ；模板RNA 3ul ；Rnase Free 6.5ul。
4.3RT-PCR 反應(yīng)程序
逆轉(zhuǎn)錄：50℃ 30min；預(yù)變性：92℃ 4min；擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)（包括：變性：94℃ 30sec ；退火：55℃ 30sec ；延伸：72℃ 45sec）； 最后延伸72℃ 10min。
4.4 瓊脂糖凝膠電泳
（1）用1×TAE 緩沖液配制瓊脂糖凝膠：準(zhǔn)確稱取瓊脂糖1g，加入100ml 1×TAE 緩沖液。在微波爐上加熱至沸騰，待冷卻至60℃左右時(shí)，加入1ul Gold View，搖勻；將凝膠倒入預(yù)先準(zhǔn)備好的制膠板上，置室溫冷卻待用。
（2）取PCR 產(chǎn)物（5~10ul）與Loding Buffer 按使用比例混合均勻后加至樣品孔中，其中一孔加入Maker，然后進(jìn)行電泳，電壓為80V，電泳時(shí)間約為30~45min ；取出凝膠在紫外燈下觀察結(jié)果。
目前，國(guó)內(nèi)禽用疫苗生產(chǎn)廠家的生產(chǎn)能力良莠不齊，生產(chǎn)疫苗所用的原料來源不清，疫苗出廠時(shí)把關(guān)不嚴(yán)，導(dǎo)致大量的問題疫苗流入市場(chǎng)。據(jù)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所1996 ～ 2000 年對(duì)666 批禽疫苗進(jìn)行抽檢，合格率僅為85％。近年來，我國(guó)一些雞群在免疫禽用活疫苗后發(fā)生了腫瘤病，這是否與疫苗污染腫瘤病毒有關(guān)，特別是與制苗所用雞胚受到外源病原的污染有關(guān)。因此，疫苗的安全性檢測(cè)至關(guān)重要，應(yīng)引起各方的重視，其檢測(cè)方法，應(yīng)在各養(yǎng)殖場(chǎng)廣泛推廣使用，為防止問題疫苗流入市場(chǎng)， 杜絕問題疫苗造成養(yǎng)禽業(yè)的損失發(fā)揮應(yīng)有的作用，保證養(yǎng)禽業(yè)穩(wěn)步高效的發(fā)展。