激素對小鼠胚胎體外發育的影響

摘要探討小鼠胚胎體外發育過程中,2種激素(孕馬血清促性腺激素PMSG、人絨毛膜促性腺激素HCG)對早期胚胎發育的影響。取原核期胚胎培養于不同的培養體系中,確定適合胚胎發育的最佳體外培養體系;在胚胎培養液中加入不同濃度的激素,觀察激素對體外發育的影響。試驗發現含10%胎牛血清的人輸卵管液培養液(HTF)是該試驗條件下小鼠早期胚胎發育的最佳培養液;在該培養液中添加不同濃度和不同種類的激素后,各發育階段胚胎的發育率與未添加激素的對照組相比均有所下降,但未發現濃度依賴性。由此可認為,高濃度的PMSG和HCG對體外培養的胚胎發育有抑制作用,可降低胚胎發育到各階段的比例,尤其是顯著降低了囊胚的發生率。
　　關鍵詞激素;小鼠胚胎;體外發育;影響

　　AbstractThe system for mouse embryo culture,and the effects of two different hormone on mouse preimplantation embryos in vitro were explored.One-cell mouse embryos were cultured in different culture media to determine the optima system,and thendifferentconcentrationhormone were added to the medium to observe the effect ofhormone on mouse embryo development in vitro. HTF +10% FBS medium was the best culture system of mouse preimplantation embryod in viting. After hormone of different concentrations and kinds were added to HTF +10% FBS medium,the development rate of different stages embryos declines compared with control group. High concentration hormone could depress development of mouse preimplantation embryos in vitro,and lessens the developmental proportion of different stage embryos,then significant decreased the occurrence of blastocyst.
　　Key wordshormone;mouse preimplantation embryos;development in vitro;effects
　　早期胚胎體外培養技術在發育生物學、胚胎移植、轉基因動物等領域的研究工作中都有很重要的作用[1]。早期胚胎發育是一個復雜的過程,在此過程中,可受到各種激素的影響,激素通過不同途徑來調控早期胚胎發育[2,3]。目前,在不孕治療中經常使用到各種促排卵激素,在孕婦妊娠期間也經常使用一些激素類藥物,有報道,使用不同劑量和不同種類的激素,可能影響到胚胎的質量[4-7]。另外,環境中也存在著多種激素的類似物,這些激素和激素類似物對胚胎發育的影響研究,目前還缺乏系統性,尤其是較高濃度的激素水平如何影響胚胎的發育、胚胎發育與激素的濃度之間是否存在著劑量依存性、同種激素對不同發育階段的胚胎的影響等,這些都還不十分明了,很有必要進行深入的研究。本研究旨在以小鼠為試驗動物模型,在基礎胚胎發育培養液中分別加入不同種類和不同濃度的激素,以探討其對鼠早期胚胎體外發育的影響機理。
　　
　　1材料與方法
　　               快速論文發表
　　1.1試驗試劑
　　孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)購自寧波第二激素廠,HTF培養液購于美國In-Vitro公司,透明質酸酶購自Vitrolife公司,BSA 粉劑購自BovomaX公司,FBS(胎牛血清)購自Gibco公司。胚胎操作液配制:CZB-HEPES(NaCl為478.9mg/100mL,KCl為36.3mg/100mL,KH2PO4為15.9mg/100mL,MgSO4為14.195mg/100mL,NaHCO3為210.0mg/100mL,C6H12O6為100.0mg/100mL,CaCl2·2H2O為25.0mg/100mL,乳酸鈉(60%糖漿)為370mg/100mL,鏈霉素為50mg/100mL,青霉素為60mg/100mL,HEPES為238.0 mg/100mL)。使用時,添加BSA粉劑4mg/mL,過濾除菌,使用前加溫,用于體外胚胎的收集和清洗操作。
　　1.2試驗動物及處理
　　昆明品系性成熟小鼠,6～8周齡,購自浙江中醫藥大學動物實驗中心,飼養于光照控制(10L∶14D)、恒溫恒濕的飼養室,自由采食飲水。雌鼠于17∶30左右腹腔注射10IU孕馬血清促性腺激素(PMSG),48h后腹腔注射10IU人絨毛膜促性腺激素(HCG),HCG注射后與正常雄鼠按1∶1比例合籠,次日清晨檢查有無陰栓。有陰栓者于注射HCG后14～21h采用頸椎脫臼法處死小鼠。 中國論文發表
　　1.3胚胎收集
　　取出輸卵管移入操作液,在體視顯微鏡下找到輸卵管膨大部,劃破輸卵管膨大部使受精卵(云霧狀)游離出來。用槍頭吸出卵團,移入含透明質酸酶的液滴中反復吹打,鏡下觀察,當受精卵游離出來后,用移卵管(自制巴氏管)吸出來移入新液滴內清洗3次,備用。
　　1.4試驗分組與胚胎培養
　　1.4.1檢查通過2-細胞阻滯情況。收集洗凈的胚胎,選擇形態較好的受精卵分為2組,分別置于HTF+10% FBS和HTF+4mg/mL BSA培養液小滴中。于37℃、5% CO2、95%空氣、飽和濕度的培養箱中培養,24h后觀察2-細胞發育情況并做好記錄。
　　1.4.2檢查培養體系。收集洗凈的胚胎,選擇形態較好的受精卵分為多組,分別置于HTF+10% FBS培養液小滴中。于37℃、5% CO2、95%空氣、飽和濕度的培養箱中培養,每 24h觀察1次,并記錄各發育階段胚胎數目。
　　1.4.3激素對胚胎發育的影響。選擇形態較好的受精卵分為多組,分別置于添加100、50、10IU/mL的HCG和100、50、10IU/mL PMSG的HTF+10%FBS培養液中。于37℃、5% CO2、95%空氣、飽和濕度的培養箱中培養,每24h觀察發育情況,并記錄各發育階段的胚胎個數。以不添加激素的HTF+10%FBS培養液作為對照組(CK)。2結果與分析
　　
　　2.1培養液中添加FBS和BSA檢查培養系統突破2-細胞阻滯效果
　　在試驗體系中,分別在HTF培養液中添加胎牛血清-FBS(10%)和牛血清白蛋白-BSA(4mg/mL),檢查培養系統能否突破小鼠胚胎發育的2-細胞阻滯情況,結果發現:添加FBS和選購的BSA均可以使原核期胚胎突破2-細胞阻滯,而以添加血清效果較好,在以下的試驗中將選擇HTF添加血清作為基礎培養液(見表1)。
　　2.2培養體系檢查
　　應用HTF+FBS