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IL9在變應性鼻炎患者外周血單個核細胞中的表達水平

作者:時間:2011-03-24 14:49:46 來源:www.6scc.cn 閱讀次數(shù):1196次 ]

【摘要】目的：檢測變應性鼻炎患者IL9的表達水平,探討IL9在變應性鼻炎發(fā)生發(fā)展中的意義。方法：收集49例變應性鼻炎患者的外周血標本，其中未治療組30例，臨床緩解組19例，另取30例健康志愿者的外周血標本作為正常對照組。采用實時熒光定量PCR(QRTPCR)檢測IL9基因在外周血中的表達水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血漿IL9含量。結(jié)果：變應性鼻炎未治療組外周血單個核細胞中IL9 mRNA表達水平及血漿IL9含量明顯高于變應性鼻炎臨床緩解組和正常對照組(P<0.05)，而變應性鼻炎臨床緩解組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。變應性鼻炎未治療組IL9 mRNA表達水平與臨床評分呈正相關。結(jié)論：變應性鼻炎患者外周血單個核細胞中IL9呈高表達。IL9可能參與了變應性鼻炎的病理過程，具體機制有待進一步探討。

【關鍵詞】變應性鼻炎; 白細胞介素9; 實時熒光定量PCR

　　Expression of IL9 in peripheral blood mononuclear cellwith allergic rhinitis patients

　　JI Junxiang1, QIAN Wei1, ZOU Chen1, MA Yongming1, LIN Zhiqiang1, CHEN Jianguo1,

　　YANG Xianzhi2, WANG Shengjun2高級工程師論文發(fā)表

　　(1.Department of Otolaryngology, the Affiliated People's Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212002; 2.Department of Immunology, School of Medical Science and Laboratory Medicine, Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212013, China)

　　[Abstract] Objective: To establish a method of realtime fluorescence quantitative PCR for detecting IL9 mRNA in human peripheral blood mononuclear cell (PBMC), and investigate the relationship between the expression of IL9 and allergic rhinitis (AR). Methods: The mRNA levels of IL9 in PBMC were determined by quantitative realtime PCR (QRTPCR), and detected the concentrations of IL9 in plasma by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) in 49 patients, including 30 untreated AR patients and 19 patients in recovering phase, and 30 healthy control volunteers. Results: IL9 mRNA expression and IL9 concentrations in the group of 30 AR patients without treatment were markedly higher than that in the groups of 19 AR patients in clinical remission and 30 healthy controls (P<0.05). but there were no significant differences between the groups of AR in clinical remission and normal control (P>0.05). Furthermore, the result of this study shows a positively correlated between IL9 mRNA and clinical count in untreated AR patients. Conclusion: These results indicated that IL9 was higher in AR patients without treatment, and suggesting that IL9 might be involved in the pathological process of AR. The role of IL9 in process of AR remains further investigation.

　　[Key words] allergic rhinitis; IL9; realtime quantitative PCR

　　變應性鼻炎(allergic rhinitis, AR) 又稱過敏性鼻炎，是耳鼻咽喉頭頸外科的常見病之一，其發(fā)病率有逐漸增高的趨勢[1]。IL9可通過抑制嗜酸性粒細胞的凋亡和促進IL5介導的嗜酸性粒細胞前體的成熟來增加組織中的嗜酸性粒細胞[2-5];另外，IL9能增加肥大細胞表面IgE高親和受體α(FcεR Iα)的表達和產(chǎn)生炎癥介質(zhì)的量, 使得肥大細胞對變應原做出反應[5];并可刺激上皮細胞而導致嗜酸性粒細胞和T淋巴細胞的浸潤，誘導上皮細胞表達產(chǎn)生粘蛋白[3-6];同時，IL9還可通過作用于平滑肌細胞來招募嗜酸性粒細胞，進而促進IL8的釋放來招募更多的中性粒細胞, 從而在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[7-9]。本研究通過檢測變應性鼻炎患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中IL9 mRNA的相對表達水平和外周血中IL9蛋白的表達水平，以探討其在變應性鼻炎中的表達變化及與變應性鼻炎發(fā)生、發(fā)展的相關性。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 臨床資料及標本 AR患者未治療組為按照中華醫(yī)學會耳鼻喉科學分會2004年蘭州會議變應性鼻炎診斷標準[10]，2008年12月至2009年9月在江蘇大學附屬人民醫(yī)院就診的30例患者(男14例，女16例，年齡13～49歲，平均29歲)，均有AR典型癥狀，經(jīng)過粉塵螨、屋塵螨、豚草等20種常見陽性變應原血清特異性IgE檢測，至少一種為陽性;臨床緩解組為AR發(fā)作期患者經(jīng)皮質(zhì)類固醇激素鼻噴劑雷諾考特、輔舒良、內(nèi)舒拿等藥物治療后(每日2次，每次1～2噴)臨床癥狀緩解1個月后復診，并經(jīng)療效評分標準顯示為有效或顯效的19例患者(男9例，女10例, 年齡14～39歲，平均年齡24歲)。另選30例健康志愿者作為正常對照組(男14例，女16例, 年齡18～42歲，平均年齡27歲)，均無AR病史及哮喘、特應性皮炎等其他變應性疾病史，吸入組變應原血清特異性IgE過篩試驗檢測陰性。根據(jù)AR癥狀和體征評分方法篩選AR臨床緩解組患者。

　　療效判定標準：(治療前總分-治療后總分)/治療前總分×100%，≥66%為顯效，65%～26%為有效，≤25%為無效。

　　AR未治療組的30例患者經(jīng)治療后，其中20例為顯效，5例為有效，5例為無效，25例有效或顯效患者停藥1個月后有3例重新出現(xiàn)部分癥狀且評分低于顯效標準。我們?nèi)コ裏o效及癥狀復發(fā)的，取19例顯效和有效且停藥1個月癥狀未復發(fā)的為臨床緩解組。

　　1.1.2 主要試劑人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制劑公司)，Trizol (Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司)，SYBR Premix Ex Taq、PMD18TA克隆試劑盒(TaKaRa公司),人IL9 ELISA試劑盒(eBiosience公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物設計及合成根據(jù)基因庫中目的基因序列，用Premier 5.0軟件設計目的基因檢測引物，由上海生物工程技術公司合成，序列見表1。表1 QRTPCR檢測引物序列及擴增范圍

　　1.2.2 PBMC的分離用肝素抗凝管收集健康志愿者、AR患者外周血2 ml，PBS以1∶1稀釋，混勻，沿管壁輕緩移入放有等體積Ficoll泛影葡胺(人淋巴細胞分離液)離心管，1 500 r/min，15 min，離心半徑10 cm，吸取分層液的云霧層，PBS洗滌，RPMI1640完全培養(yǎng)基(10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)重懸，計數(shù)，以1×106 個細胞/ml加1 ml Trizol，置-70 ℃冰箱凍存。

　　1.2.3 構建目的基因質(zhì)粒標準品以上述制備的cDNA為模板，選取下列最佳的特異性擴增條件：① 反應體系：10×PCR 緩沖液2 μl，dNTP 1.6 μl，上下游引物各0.3 μl(10 pmol/L)，cDNA模板1.0 μl，Taq DNA聚合酶(5 U/μl) 0.2 μl，MgCl2(25 mmol/L) 0.8 μl，ddH2O 13.3 μl。② 反應條件：變性，94 ℃ 30 s;退火,IL9 58 ℃ (β肌動蛋白56 ℃) 30 s;延伸,72 ℃ 30 s，35個循環(huán)。將目的基因PCR擴增產(chǎn)物TA克隆，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，挑取陽性克隆質(zhì)粒，并送上海生物工程公司測序鑒定。所選陽性質(zhì)粒倍比稀釋至108～104拷貝數(shù)/μl，備用。高級工程師論文發(fā)表

　　1.2.4 RotorGene 6000熒光定量PCR儀檢測目的基因表達采用絕對定量法檢測目的基因mRNA的表達水平，SYBR Green Ⅰ法檢測熒光。所有樣本的檢測值都用β肌動蛋白進行校準。

　　1.2.5 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件中KruskalWallis H檢驗，3組數(shù)據(jù)進行兩兩比較利用Nemenyi法檢驗，采用Spearman秩相關分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 IL9和β肌動蛋白基因PCR擴增產(chǎn)物

　　以AR患者外周血cDNA為模板，PCR擴增IL9和β肌動蛋白基因，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見圖1。

　　1: DL2000標準參照物; 2: IL9; 3: β肌動蛋白

　　圖1 AR患者外周血IL9和β肌動蛋白

　　PCR擴增產(chǎn)物鑒定

　　Fig 1 Identification of amplification of IL9 and βactin

　　by PCR in patients with AR

　　2.2 實時熒光定量PCR法建立β肌動蛋白和IL9標準曲線

　　以β肌動蛋白各梯度濃度標準質(zhì)粒為模板，定量PCR擴增β肌動蛋白，重復3次。圖2a為熔解曲線，未見雜峰，表明擴增特異性較好;圖2b為QRTPCR擴增動力學曲線，呈典型的S形，平臺期匯于一條直線上，指數(shù)區(qū)明顯，斜率大且固定(平行線);圖2c為定量結(jié)果，顯示標準品濃度梯度對應的擴增后的拷貝數(shù);圖2d中標準曲線的斜率為3.371;截距為40.703;相關系數(shù)為為0.99;擴增效率0.98。以不同濃度梯度IL9標準質(zhì)粒為模板，QRTPCR擴增IL9，重復3次。圖3a為熔解曲線，峰尖在同一中軸上，表明擴增特異性較好;圖3b為QRTPCR擴增動力學曲線，平臺期集中同一直線上，指數(shù)區(qū)明顯，斜率固定;圖3c為定量結(jié)果，顯示與標準品濃度梯度相對應的擴增后的拷貝數(shù);圖3d中標準曲線的斜率為3.513;截距為34.214;相關系數(shù)為0.999;擴增效率為0.93。

　　2.3 AR患者未治療組、AR臨床緩解組與健康對照組IL9 mRNA表達比較

　　實時熒光定量PCR方法檢測3組IL9 mRNA相對表達。結(jié)果顯示，AR未治療組、AR臨床緩解組和正常對照組之間IL9 mRNA相對表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，AR 未治療組IL9 mRNA的相對表達水平明顯高于臨床緩解組和正常對照組(P<0.01);而臨床緩解組IL9 mRNA的相對表達水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。
2.4 AR 患者IL9 mRNA 相對表達水平與癥狀、體征記分相關性分析

　　結(jié)果表明，AR患者未治療組IL9 mRNA 相對表達水平與癥狀、體征記分呈正相關(n=30,r=0.602,P<0.001)。見圖5。

　　2.5 AR患者血漿IL9表達水平

　　30例AR未治療患者、19例AR臨床緩解者和30例健康志愿者的血漿嚴格按IL9 ELISA試劑盒操作說明檢測，采用非參數(shù)秩和檢驗統(tǒng)計分析，結(jié)果以箱圖表示(圖6)，AR未治療患者血漿IL9的含量高于AR臨床緩解者和健康志愿者(P<0.05)，AR臨床緩解者和健康志愿者之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

　　3 討論

　　在哮喘病患者體內(nèi)，IL9作用于炎癥細胞和組織細胞，使淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞的量增多，提高了IgE的分泌量，增強了肥大細胞對變應原的反應，誘導黏蛋白的表達，并促進炎癥細胞分泌一些細胞因子參與炎癥反應。隨著研究的進一步發(fā)展，還認為IL9在氣道高反應性和哮喘表型中起了重要的作用[11, 12]。

　　本研究檢測了AR患者外周血單個核細胞中IL9 的mRNA和蛋白表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AR患者未治療組IL9的表達水平高于AR患者臨床緩解組和健康對照組，而AR患者緩解組與健康對照組IL9的表達水平無顯著性差異，提示AR患者體內(nèi)存在著IL9的高表達，進一步研究表明IL9的表達水平與疾病的臨床評分呈正相關。提示了IL9在AR的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用。高級工程師論文發(fā)表

　　Nicolaides等[12]的體外試驗已經(jīng)證實IL9的產(chǎn)生與Th9的數(shù)量密切相關，而IL9又可促進Th9細胞分泌IL9，并具有維持Th9表型的功能，因而，有可能在變應性疾病免疫內(nèi)環(huán)境IL9促進了Th9細胞的分化，而Th9的增多使得IL9的分泌又增多，從而形成一條正反饋的效應。這一機制的存在還有待于進一步探討。

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