辣椒連坐土壤中真菌分析

【內(nèi)容摘要】：本實(shí)驗(yàn)通過馬丁氏培養(yǎng)基進(jìn)行微生物的培養(yǎng)，以一年生，連作兩年，三年辣椒連作土壤為實(shí)驗(yàn)對象， 分離純化其中的真菌并進(jìn)行了數(shù)量統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，種植一年，連作二年，三年土壤中真菌數(shù)量有明顯變動(dòng)，三年土壤中的真菌數(shù)量較一年土壤中的真菌數(shù)量有兩個(gè)到三個(gè)數(shù)量級的提高。
【關(guān)鍵詞】: 辣椒 土壤 真菌
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模悍蛛x純化辣椒連作土壤中的真菌并計(jì)數(shù)。
實(shí)驗(yàn)原理：土壤是微生物生活的大本營，是尋找和發(fā)現(xiàn)有重要應(yīng)用潛力的微生物的主要菌源。真菌在土壤中的數(shù)量僅次于細(xì)菌和放線菌，。分離土壤中的真菌并不難，但由于其菌落大，容易擴(kuò)展，技術(shù)準(zhǔn)確性較低。本實(shí)驗(yàn)采用加有鏈霉素（或氯霉素、慶大霉素）和孟加拉紅的馬丁氏培養(yǎng)基分離土壤中的真菌。在此培養(yǎng)基上，放線菌和細(xì)菌被鏈霉素和孟加拉紅所抑制， 但大多數(shù)真菌能夠生存，且其菌落受孟加拉紅的抑制而較小， 從而避免了某些真菌的擴(kuò)散蔓延而帶來的數(shù)量上的誤差。
實(shí)驗(yàn)器材和材料：
（1） 器材：臺秤、電子秤、燒杯、試管、移液管、移液槍、無菌培養(yǎng)皿、接種環(huán)。
（2）材料：連作辣椒土壤、無菌水、馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基。
（3）試驗(yàn)方法和步驟：
1 采樣
（1）采樣地點(diǎn)：酒泉辣椒種植區(qū)
（2）采樣方法：五點(diǎn)取樣法、蛇形取樣法
（3）具體步驟：選取辣椒種植一年的土壤，在距其表面5 厘米10 厘米15 厘米20 厘米處進(jìn)行取樣，連作兩年、三年的土壤依上述步驟分別進(jìn)行取樣。
2 真菌分離培養(yǎng)基的制備
配方： 葡萄糖10.0g 、蛋白胨5.0g 、瓊脂 20g 、K2HPO4 1.0g 、MgSO4 •7 Ｈ 2O 0.5g 、1/3000 孟加拉紅水溶液100mL、0.03 ℅ 鏈霉素稀釋液100mL、自來水800mL。
操作步驟：
1） 用搪瓷杯量取自來水500mL 置小鋁鍋中，在電爐上加熱。
2） 按配方分別稱取各種藥品，加入自來水中，邊加邊攪拌，然后量取100mL1/3000 孟加拉紅水溶液加入。
3） 加入20g 浸洗過的瓊脂煮沸至溶化。
4） 總體積定容至900mL，無需調(diào)節(jié)pH 值。
5） 趁熱分裝于兩個(gè)規(guī)格為500ml 的錐形瓶中。
6） 高壓蒸汽滅菌，121℃滅菌30min，備用。
注意：1） 取國產(chǎn)鏈霉素1g/ 瓶，用無菌吸管吸入10mL 無菌水溶解，得到10% 鏈霉素溶液。取0.3mL 該溶液定容于100mL 滅菌容量瓶即可得到0.03% 鏈霉素溶液。2） 使用前， 將上述培養(yǎng)基熔化冷卻至55 ～ 60℃，按每10mL 培養(yǎng)基加入1mL0.03% 鏈霉素溶液，即可使每毫升培養(yǎng)基含30ug 鏈霉素。
3 土壤稀釋液的制備
分別稱取連作1,2,3 年的土樣1g 放入盛9mL 無菌水的三角瓶中，振搖約20 分鐘，使土與水充分混合，將菌分散。在無菌操作條件下，用無菌移液管吸取lmL 的菌液于一管9mL 無菌水中，將移液管吹洗三次，搖勻即為10-2 濃度菌液。同樣方法，依次稀釋到10-8。最終只取稀釋至10-6、10-7、10-8。（在土壤稀釋過程中，吸取不同梯度的菌液需換用不同的吸管）
3.1 平板分離
（1）倒平板
將加入鏈霉素溶液的馬丁氏培養(yǎng)基倒平板
（2）涂布 將倒好的平板分成3 份，分別標(biāo)上1 年、2 年、3 年。將每份培養(yǎng)基分為3 組平板分別標(biāo)上10-6、10-7、10-8 三種稀釋度，然后用三支1mL 無菌吸管分別由10-6、10-7、10-8 三管土壤稀釋液中各吸取100ul 對號放于已標(biāo)好稀釋度的平板中，用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻。
（3）恒溫培養(yǎng) 將上述接種土壤懸液的平板倒置于28℃培養(yǎng)3-5d。
（4） 挑菌純化 從長有單菌落的平板中選取典型的真菌菌落轉(zhuǎn)接斜面，并同時(shí)制片作純度檢查，若不純，應(yīng)進(jìn)一步挑取該菌落制成菌懸液進(jìn)一步作稀釋分離，直至獲得純培養(yǎng)體為止。
（5）計(jì)數(shù) 選擇每皿出現(xiàn)0 ～ 100 個(gè)菌落的平板，計(jì)算土壤真菌（包括酵母菌）的含量。選擇好計(jì)數(shù)的稀釋度后，即可統(tǒng)計(jì)在平板上長出的菌落數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果按下式計(jì)算：每g 樣品的菌數(shù)= 同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×10× 稀釋倍數(shù)
3.2 菌種保存
將分離到的真菌轉(zhuǎn)接到PDA 斜面上培養(yǎng)，待長好后，置于冰籍中保存。
結(jié)果分析：
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：
菌落計(jì)數(shù)第一次（表1）
菌落計(jì)數(shù)第三次（表2）
結(jié)果與分析：
在對不同樣本的真菌進(jìn)行計(jì)數(shù)之后，我們發(fā)現(xiàn)連作三年的土壤真菌含量較種植辣椒一年的土壤中真菌的含量有三個(gè)數(shù)量級的提高，較連作兩年的土壤也有一個(gè)數(shù)量級的提高。
另外查閱相關(guān)文獻(xiàn)得知種植一年辣椒土壤與普通菜地之間真菌含量的差異不大，可以初步認(rèn)為是連作是使得土壤由真菌化由細(xì)菌化的轉(zhuǎn)化的因素之一。
土壤在對數(shù)據(jù)分析時(shí)我們發(fā)現(xiàn)數(shù)量變化幅度較為明顯的真菌大多為霉菌，因此，我們對霉菌的數(shù)量變化又單獨(dú)做了比較，發(fā)現(xiàn)其數(shù)量變化幅度基本與真菌變化幅度相一致，從而得連作辣椒土壤中影響土壤類型的真菌主要為霉菌。
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[7] 不同土地利用方式下土壤微生物數(shù)量與土壤肥力的關(guān)系 章家恩，劉文高，胡剛 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶亞熱帶生態(tài)研究所，廣東廣州 510642.