外源基因在大腸桿菌中的表達與鑒定

【內(nèi)容摘要】：外源基因在大腸桿菌中的表達具有復(fù)雜性， 不同的外源基因、不同的表達系統(tǒng)會產(chǎn)生完全不同的表達產(chǎn)物狀態(tài)。通過基因重組可將外源基因?qū)�人細胞，并使之進行擴增或表達。在生命科學的研究中，基因重組已經(jīng)不僅是研究的目的，而且日益成為一項重要的研究手段，所以有著不可替代的地位。本文將通過最基本的流程進行重組操作，目的是使外源基因在大腸桿菌中進行表達。
【關(guān)鍵詞】: 外源基因 大腸桿菌 表達 鑒定
大腸桿菌是迄今為止研究得最詳盡、應(yīng)用最廣泛的原核生物種類之一，也是基因工程研究和應(yīng)用中最完善和成熟的受體系統(tǒng)。與其他系統(tǒng)相比，大腸桿菌受體系統(tǒng)具有以下優(yōu)點：①遺傳背景清楚，其K-12MGl655 株大于4000kb 的染色體DNA 已測序，全基因組共含有4405 個開放閱讀框，其中大部分基因的生物功能已被鑒定。②培養(yǎng)周期短。③目標基因表達水平高。④代謝途徑和基因表達調(diào)控機制比較清楚。⑤已有大量可供選擇利用的表達載體。這些優(yōu)點使大腸桿菌在許多的科學研究及應(yīng)用開發(fā)中成為蛋白質(zhì)表達的首選受體，缺點是大腸桿菌缺乏復(fù)雜的翻譯后加工及蛋白質(zhì)折疊系統(tǒng)，得到的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可能缺乏某些天然蛋白質(zhì)所具有的活性，另外大腸桿菌也難以胞外分泌表達。
1 外源基因在大腸桿菌中的表達內(nèi)涵
基因在原核細胞中的表達主要包括兩個過程：DNA 轉(zhuǎn)錄成mRNA 和mRNA 翻譯成蛋白質(zhì)。與真核細胞相比，原核細胞作為表達系統(tǒng)有以下特點：①原核生物只有一種RNA 聚合酶( 真核細胞有三種) 識別原核細胞的啟動子。②原核生物的表達是以操縱子為單位的。操縱子是由若干功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控區(qū)組成的，是基因表達的協(xié)同單位。調(diào)控區(qū)主要包括0 區(qū)、啟動子及其他有調(diào)控功能的部位。③由于原核生物無核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，也是連續(xù)進行的。DNA 轉(zhuǎn)錄成mRNA 后，mRNA 直接在胞漿中與核糖體結(jié)合翻譯成蛋白質(zhì)，事實上， 當mRNA 的合成還沒有完成時，蛋白質(zhì)翻譯就開始了。④原核基因一般不含有內(nèi)含子，在原核細胞中缺乏真核細胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。因此含有內(nèi)含子的真核基因在原核細胞中轉(zhuǎn)錄成mRNA 前體后，其中的內(nèi)含子不能被切除。⑤在大腸桿菌mRNA 的核糖體結(jié)合位點上，含有與16S rRNA 3’末端堿基互補的序列，即SD 序列，而真核基因則缺乏此序列。⑥原核生物基因表達的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平，而真核生物基因表達調(diào)控除有轉(zhuǎn)錄水平外，還有DNA 水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平和翻譯后水平等多級水平的調(diào)節(jié)。
根據(jù)上述特點，要使外源基因在大腸桿菌中表達，從表達載體來說，除了包括復(fù)制子、多克隆位點、選擇標記基因等克隆載體必要的元件之外，還必須構(gòu)建合適的啟動子、終止子和SD 序列等調(diào)控區(qū)，從受體細胞來說，必須能人工調(diào)控外源基因的表達，當細胞生長到一定濃度時，才進行誘導表達，防止外源基因產(chǎn)物過早表達對細胞的毒害，同時還要盡可能降低內(nèi)源蛋白酶對產(chǎn)物的降解。載體和受體相互適應(yīng)，才能實現(xiàn)外源基因的高效表達及產(chǎn)物在宿主中良好的穩(wěn)定性，目前已經(jīng)成功發(fā)展了許多表達載體和相應(yīng)的大腸桿菌宿主菌。
2 外源基因在大腸桿菌中表達的形式
外源基因在大腸桿菌中的表達產(chǎn)物可能存在于細胞的不同位置，如細胞質(zhì)、細胞周質(zhì)及細胞外培養(yǎng)基中，外源蛋白以可溶性形式或不溶性包涵體形式存在，根據(jù)表達的蛋白質(zhì)有無外加序列，外源蛋白又有融合型表達與非融合型表達之分。
2.1 包涵體形式的表達
在一定條件下，外源基因的表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)積累并致密地聚集在一起形成無膜的裸露結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)稱為包涵體。包涵體主要存在于細胞質(zhì)中，在某些條件下也能在細胞周質(zhì)中形成。
包涵體大小為0.1 ～ 1μm，無定形，具有很高的密度( 約1.3mg/ mL)，呈非水溶性。包涵體主要由蛋白質(zhì)組成，并且大部分蛋白質(zhì)為外源基因的表達產(chǎn)物，也含有宿主細胞本身的一些其他表達產(chǎn)物如RNA 聚合酶、核糖核蛋白體、外膜蛋白等。包涵體具有正確的氨基酸序列，但因其空間構(gòu)象錯誤，故一般沒有生物學活性。由于包涵體中的蛋白質(zhì)組分大都失去了天然的空間構(gòu)象，且所有的分子緊密積聚成顆粒狀，因此在水溶液中很難溶解，只有在高濃度的變性劑如鹽酸胍和尿素等溶液中才能形成均相。
2.2 胞內(nèi)可溶性表達
某些蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性很困難或者不可能，進行胞內(nèi)可溶性表達是更好的選擇。有多種方法可以提高外源蛋白的活性表達比例，減少包涵體的生成。
優(yōu)化培養(yǎng)條件多種蛋白質(zhì)在23 ～ 30℃誘導時能夠得到活性，而在37℃誘導表達則不行。降低培養(yǎng)溫度已成為實現(xiàn)蛋白質(zhì)活性表達的共識，常用來表達可溶性蛋白。在較低培養(yǎng)溫度下， 蛋白質(zhì)合成速率減慢，其自身聚集趨勢減弱，從而有利于蛋白質(zhì)產(chǎn)物正確折疊。這點來看，構(gòu)建表達載體時使用中等強度或較弱的啟動子，或者雖是強啟動子，但受有限的誘導，也有利于蛋白質(zhì)可溶性表達。另外，改變培養(yǎng)液的pH 或加入山梨醇及甜菜堿等物質(zhì)，能使宿主菌發(fā)生滲透壓應(yīng)激，均可能增加可溶性蛋白比例，減少包涵體生成。
2.3 外源蛋白的融合型表達
融合表達一般是將外源基因引入某表達載體編碼的高表達蛋白( 融合頭) 序列的3’末端，使融合頭序列和外源基因在同一閱讀框架下表達，所表達的蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。融合頭序列通常是大腸桿菌的一段序列，也可以是其他在大腸桿菌中高效表達的基因，編碼的可能是整個功能蛋白或蛋白質(zhì)的一部分，如β 一半乳糖苷酶融合蛋白、谷胱甘肽S- 轉(zhuǎn)移酶(GST) 融合蛋白和硫氧還蛋白(TrxA) 融合蛋白等。
2.4 外源蛋白的分泌型表達
分泌型表達是指蛋白質(zhì)以帶N 端信號肽的前體形式在細胞質(zhì)中合成，然后再穿膜運送號肽被酶切除。將外源基因置于適合的信號肽序列下游可能實現(xiàn)分泌型表達。
外源蛋白的分泌型表達有許多優(yōu)點：①信號肽被切除后的蛋白質(zhì)N 端氨基酸殘基與天然蛋白質(zhì)是一致的，避免了表達時N 端附加的甲硫氨酸對蛋白質(zhì)活性可能產(chǎn)生的影響。②周質(zhì)空間中的蛋白酶活力比細胞質(zhì)中低，使外源蛋白能更穩(wěn)定地存在于周質(zhì)中，例如，重組人胰島素原合成后若分泌到細胞周質(zhì)中，其穩(wěn)定性大約是在細胞質(zhì)中的10 倍。③周質(zhì)中只有少量的細菌蛋白質(zhì)，約占細菌總蛋白質(zhì)4％，使產(chǎn)物純化相對簡單，分泌到培養(yǎng)基中則更易分離純化。④不同于細胞質(zhì)，周質(zhì)空間提供了一個氧化環(huán)境，更有利于二硫鍵的正確形成。
3 外源基因在大腸桿菌中高效表達的策略
3.1 組裝強啟動子和終止子
不同啟動子起始效率不同，理想的啟動子應(yīng)該具有起始轉(zhuǎn)錄作用強、受嚴緊調(diào)控、誘導方式簡便廉價等特點。因此，在構(gòu)建大腸桿菌表達載體時一般選用強啟動子及可調(diào)控的誘導型啟動子，但有時為了促進目標蛋白可溶性表達、減少包涵體生成，也會選用中等強度或較弱的啟動子。另一方面的要求是啟動子的位置，因為啟動子與外源基因轉(zhuǎn)錄起始位點之間的距離會影響基因的轉(zhuǎn)錄效率，在大腸桿菌中，一般為6—9 對堿基。若將目標基因插在一個較強啟動子下游，卻檢測不到相應(yīng)的mRNA，就要考慮調(diào)整啟動子和基因之間的距離。
3.2 減少外源基因稀有密碼子對表達的影響
無論是原核生物還是真核生物，基因中對編碼同一個氨基酸的簡并密碼子的使用都不是隨機的，而是表現(xiàn)出對特定密碼子使用的偏愛性，偏愛使用的密碼子對應(yīng)的tRNA 豐度較高，而那些稀有密碼子對應(yīng)的tRNA 豐度則較低。基因呈現(xiàn)的密碼子偏愛性越強，其蛋白質(zhì)合成速率越快，因此表達量大的基因，密碼子偏愛性高于表達量低的基因，這也是生物調(diào)節(jié)基因表達的共同策略之一，不同的是，原核生物和真核生物對簡并密碼子具有不同的偏愛性，這樣，真核生物尤其是哺乳動物的基因在大腸桿菌中表達時會出現(xiàn)大腸桿菌稀少使用的密碼子，從而嚴重影響其表達效率。
有兩種策略使稀有密碼子含量較高的外源基因在大腸桿菌中獲得高表達：一是在大腸桿菌中共表達稀有密碼子的tRNA 基因，以提高稀有密碼子tRNA 在大腸桿菌中的豐度；二是在不改變外源基因編碼蛋白一級結(jié)構(gòu)的前提下，按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)律，通過基因全合成或基因定點突變的方法，將外源基因中的稀有密碼子更換為大腸桿菌中的偏愛密碼子。
3.3 提高外源基因表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性
蛋白質(zhì)降解作用在生物細胞中普遍存在，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解可以降低代謝途徑中酶的存量、滅活某些細胞調(diào)控因子、清除代謝中產(chǎn)生的錯誤折疊蛋白質(zhì)或其他形式的結(jié)構(gòu)異常蛋白質(zhì)， 從而實現(xiàn)細胞正常的代謝平衡，因而細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解具有重要的生物學功能。細胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解作用具有顯著的選擇性， 表現(xiàn)為細胞存在復(fù)雜的蛋白酶系統(tǒng)和蛋白質(zhì)修飾系統(tǒng)，通過特異性識別作用，細胞完成對靶蛋白的選擇性降解。
4 結(jié)論
總之，由于待表達的外源基因結(jié)構(gòu)具有多樣性，尤其是真核基因與宿主大腸桿菌基因存在著明顯差異，要使目標基因在大腸桿菌中獲得高效表達并制備出相應(yīng)的活性產(chǎn)物，還需要根據(jù)每一個基因的情況，結(jié)合采用的載體- 受體系統(tǒng)加以分析，制定出適當?shù)母咝П磉_策略。
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