四種微量石蠟組織DNA提取方法的比較

【摘要】  目的：探討從微量福爾馬林固定石蠟包埋組織（formalin fixation and paraffin embedded tissues，F(xiàn)FPET)中提取DNA的簡單而高效的方法。方法：采用Chelex��100提取法、酚氯仿抽提法、單純消化法、水煮法4種方法提取組織DNA；應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增100～500bp長度DNA片段，然后進(jìn)行電泳分析，1年后重復(fù)PCR電泳分析。結(jié)果：小于200bp長度DNA片段擴(kuò)增，Chelex��100提取法、單純消化法陽性率分別為88.8%、78.8%，明顯優(yōu)于酚氯仿抽提法（15.0%）（P<0.01）及水煮法（21.3%）（P<0.01）。隨著擴(kuò)增長度的增加，PCR擴(kuò)增效率逐漸降低，Chelex��100提取法PCR反應(yīng)總陽性率為82.5%，單純消化法為66.5%，水煮法為13.4%，酚氯仿抽提法為13.4%。1年后重復(fù)PCR總陽性率分別為80.1%、31.7%、2.5%、9.2%。結(jié)論：Chelex��100提取法方便簡單，適用于微量石蠟組織DNA擴(kuò)增分析；單純消化法及水煮法在一定條件下適用于微量石蠟組織短片段DNA的擴(kuò)增。

【關(guān)鍵詞】  石蠟組織;DNA提取;Chelex��100提取法
  

［ABSTRACT］ Objective: To explore the simple and effective method for DNA extraction from microamount formalin fixation and paraffin embedded tissues (FFPET). Methods: The DNA was extracted by four different methods: Chelex��100 extraction, phenol�瞔hloroform purification, simple digestion method and water cooking method. The DNA fragment with 100��500 bp length was amplified by PCR. It was analyzed by electrophoresis, and the procedure including PCR and analysis was repeated 1 year later. Results: For amplification of DNA less than 200 bp, the positive rates of Chelex��100 group and simple digestion group were 88.8% and 78.8%, respectively, which were significantly effective than phenol�瞔hloroform purification group (15.0%) (P<0.01) and water cooking group (21.3%) (P<0.01). The amplication efficacy decreased as the length increase. The total positive rates of PCR were 82.5% in Chelex��100 group, 66.5% in simple digestion group, 13.4% both in water cooking group and phenol�瞔hlorform group. And the positive rates in repeated assessment were 80.1%, 31.7%, 2.5% and 9.2%. Conclusions: Chelex��100 extration method is easy and applicable in amplification analysis of DNA extracted from mircoamount paraffin embedded tissues; while simple digestion method and water cooking method are suitable to analysis of short length DNA fragment extracted from mircoamount paraffin embedded tissues.
   
［KEY WORDS］ Paraffin embedded tissue; DNA extraction; Chelex��100 extraction
    醫(yī)院病理科存在大量各種疾病甲醛固定石蠟包埋組織（formalin fixed and paraffin embedded tissues， FFPET），為分子病理研究提供了大量的信息來源。然而福爾馬林固定后的蠟塊包埋組織DNA降解嚴(yán)重［1］，檔存FFPET組織切取量有限，傳統(tǒng)酚氯仿提取DNA步驟繁雜，提取過程損失嚴(yán)重等都制約了石蠟組織在分子病理學(xué)中的研究應(yīng)用［2］。如何高效、高質(zhì)量提取微量石蠟組織DNA對利用石蠟組織進(jìn)行分子研究至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)在前人及前期研究的基礎(chǔ)上［3］，進(jìn)一步探討改善石蠟包埋組織DNA的提取方法及各種方法在不同條件下的應(yīng)用。期刊論文發(fā)表網(wǎng)

1   材料與方法

1.1  材料

   
選用海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2006～2007年間存檔的胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、結(jié)腸癌石蠟包埋組織各25例。所用物品包括PCR儀(Biometra)、蛋白酶K(Merck公司)、Taq DNA聚合酶(北京華美)、Chelex��100(Bio�睷ad I～boratory)。

1.2  方法

黃幼生等.四種微量石蠟組織DNA提取方法的比較 
1.2.1  提取DNA方法  將每例石蠟包埋組織塊切片6μm厚，分裝于4個EP管中，每管5片(鼻咽癌組織10片)，切不同病例的蠟塊時用二甲苯擦洗刀片2遍，以免交叉污染。先統(tǒng)一去蠟：在每管中加入二甲苯1mL置于55℃恒溫?fù)u床中，20min后12000r/min離心10min，去上清，加入新鮮二甲苯重復(fù)一次；再用無水乙醇洗滌2次以脫去二甲苯，離心后棄上清，在55℃恒溫箱干燥沉淀。采用4種方法提取DNA：（1）單純消化法：用100μL的組織裂解液（0.2%SDS，10mmoL/L TrispH8.0，0.5mmoL/LEDTApH 8.0）懸浮沉淀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)消化，55℃振搖8h或過夜至溶液澄清。98℃加熱10min滅活蛋白酶K，冰上3min，12000r/min 離心取上清（DNA在上清液中），4℃儲存?zhèn)溆�。�?）Chelex��100提取法：步驟同單純消化法，提取上清后，在上清液中加入5%Chelex��100顆粒，4℃過夜儲存?zhèn)溆�。�?） 酚氯仿抽提法：在EP管中加入200 mL蛋白酶K緩沖液(50 mmol/L Tris�睭Cl pH 8.0，5 mmol/LEDTA pH 8.0，0.2%Tween��20)及5 μL 蛋白酶K(20mg/mL)，置55℃水浴振搖過夜，取出后煮沸10min，離心，取上清；用等量酚—氯仿—異戊醇抽提2次；加2.5倍冰無水乙醇(-20℃)和1/10體積3mol/L乙酸鈉沉淀DNA，-20℃靜置